中国野生毛葡萄转录因子JAZ和TLP基因抗病功能研究

发布时间：2020-05-06 15:06

【摘要】：葡萄(Vitis vinifrea L.)作为世界性水果代表之一,其栽培极易受到外界气候和病虫害危害,尤其是欧洲葡萄极易受到白粉病、灰霉病、霜霉病和黑痘病等的侵染,中国野生葡萄等对多种病原菌表现高度抗性或免疫。本文以课题组前期研究为基础,一方面开展毛葡萄(Vitis quinquangularis)‘商-24’转录因子VqJAZ4和VqJAZ9的抗病功能研究,分别利用VqJAZ4和VqJAZ9转基因拟南芥株系研究2个基因对白粉病和灰霉病的抗病响应,分析VqJAZ4的启动子序列,并利用酵母双杂交技术筛选与VqJAZ4互作基因。另一方面,对葡萄TLPs基因家族进行鉴定和生物信息学分析,预测和定位葡萄TLPs对不同病原菌的响应。采用RT-PCR从‘商-24’克隆VqTLP15和VqTLP29,利用转基因拟南芥株系对VqTLP15和VqTLP29进行抗病功能研究。取得的主要结果如下:1、采用RT-PCR技术从抗病毛葡萄‘商-24’中克隆VqJAZ4 cDNA全长序列,该基因开放阅读框861 bp,编码286个氨基酸。构建VqJAZ4过量表达载体转化拟南芥,转基因株系提高了对白粉病的抗性,而对灰霉病的抗性降低。基因表达分析结果显示,白粉病诱导后,VqJAZ4转基因株系受SA与JA信号通路共同调节参与对白粉病的抗性响应,而灰霉病接种处理后,VqJAZ4抑制JA信号通路中的MYC2-支径,导致转基因株系降低了对灰霉病的抗性。VqJAZ4编码区不具备自激活活性,通过酵母双杂交文库筛选,获得互作GDSL脂肪酶基因。最终将VqJAZ4过量表达转化感病的欧洲葡萄‘无核白’体细胞胚,获得38个转基因葡萄阳性株系。此外,从毛葡萄‘商-24’中同源克隆VqJAZ4上游1,465 bp启动子片段,该片段含有响应于植物抗逆境胁迫、植物激素和防御反应等多个顺式作用元件,表明VqJAZ4启动子可能参与调控葡萄响应生物与非生物的诱导反应。2、从抗病毛葡萄‘商-24’中同源克隆开放阅读框807 bp的VqJAZ9,该基因编码268个氨基酸。构建VqJAZ9过量表达载体转化拟南芥,白粉病接种转基因株系后,VqJAZ9通过参与调控SA与JA信号通路相关基因的表达提高了对白粉病的抗性,灰霉病接种处理后,转基因株系中JA信号通路起到主导作用,VqJAZ9能参与抑制JA信号通路中的MYC2-支径,导致转基因株系降低了对灰霉病的抗性,其功能与VqJAZ4相似。自激活试验发现VqJAZ9编码区不具备自激活活性。3、利用葡萄基因组数据库,鉴定获得了葡萄TLPs基因家族33个成员,按照染色体的位置命名为VvTLP1-VvTLP33,其中29个基因包含完整的典型的thaumatin结构域。进化树分析的结果将葡萄VvTLP基因家族被分成4个亚家族:第I、II、III和IV亚家族,分别占据的比例为27.27%、54.55%、3.03%和15.15%。基因结构和蛋白结构分析表明了葡萄VvTLP进化关系的多样性。同线性分析发现,葡萄18个基因(VvTLP1、VvTLP2、VvTLP3、VvTLP6、VvTLP7、VvTLP8、VvTLP9、VvTLP10、VvTLP11、VvTLP12、VvTLP13、VvTLP15、VvTLP16、VvTLP25、VvTLP26、VvTLP27、VvTLP31和VvTLP32)在葡萄第1、2、3、4、15和18号染色体上发生相互的串联重复,且葡萄12个VvTLP和拟南芥15个AtTLP之间发生20对串联重复。利用PCR技术分析葡萄33个VvTLP不同的表达模式,分别使用黑痘病接种处理抗病葡萄‘商-24’和感病葡萄‘红地球’,白粉病接种处理抗病葡萄‘商-24’和感病葡萄‘湖南-1’,灰霉病接种处理抗病葡萄‘双优’和感病葡萄‘红地球’,结果表明,黑痘病接种后提高了23个基因的表达量;白粉病接种后提高了14个基因的表达量;灰霉病接种后提高了19个基因的表达量,其中6个基因(VvTLP3、VvTLP6、VvTLP7、VvTLP8、VvTLP12和VvTLP29)的表达水平同时表现出上升。4、采用RT-PCR技术从抗病毛葡萄‘商-24’克隆了VqTLP15和VqTLP29 cDNA全长序列,分别具有891 bp和735 bp的开放阅读框,编码296个和244个氨基酸,而且与已知的黑比诺同源基因GSVIVT01018769001和GSVIVT01008423001的高度同源。VqTLP15和VqTLP29的蛋白序列分析发现都存在信号肽裂解位点。利用葡萄原生质体研究发现这两个基因均定位于细胞质基质。构建过量表达载体转化拟南芥,VqTLP15转基因株系提高了对白粉病和假单胞菌DC3000的抗性,降低了对灰霉病的抗性。相关基因的表达分析发现VqTLP15过量表达能影响SA和JA/Eth信号通路,改变拟南芥对白粉病、灰霉病和DC3000的免疫反应。VqTLP29的抗病功能与VqTLP15相似,VqTLP29转基因株系也提高了对白粉病和DC3000的抗性,降低了对灰霉病的抗性。相关基因的表达分析表明VqTLP29过量表达可以作为一种调节因子,通过影响SA或JA/Eth信号通路诱发拟南芥对白粉病、灰霉病和DC3000的多种免疫反应。
【图文】：

组成图,信号级联,组成图,核心

变体中 JA 含量的增加会加速蛋白降解过程。拟南芥 JAZ7 突变体7 受到抑制后，突变体增强了对 JA 的敏感性，JAZ7 突变体中 JA 的表达水平上升，影响拟南芥植株的生长发育，降低了对细菌病害AZ7 与转录因子 MYC3、MYC4 或阻遏物（JAM1）相互作用，，同与TPL结合介导转录抑制作用。拟南芥JAZ7突变体中失调的异源J成COI1-JAZ-TPL-TF的复合物，导致激活了JA信号通路（Louise e，JAZ 蛋白可以通过与 MYC2 转录因子的相互作用，还能转录激的表达（Abe et al. 2003）。此外，水稻 OsJAZ9 转基因株系表现的耐受性，但 OsJAZ4 不受 JA 诱导表达（Ye et al. 2009）。拟南Z 都可以通过与 MYC 结合产生抗病功能。拟南芥 JAZ5 和 JAZ10 的转录重新编程，共同参与限制 COR 细胞毒性和病原菌的生长MYC2 的调节，也不需要同源的 MYC3 和 MYC4。拟南芥 jaz5/jaz1双突变体株系主要由 SA 信号途径介导参与防御病原菌的入侵（

序列,葡萄,染色体定位,线性分析

不同颜色分别标记葡萄 1-19 号染色体，圆圈中的曲线图表示 VVJAZ 序列之间的串联重复区域。Figure 2-2 Chromosome distribution and synteny analysis of grape VVJAZChromosomes 1-19 are shown in different colors in a circular diagram. The approximate distribution oeach VVJAZ is marked with a short red line on the circle. Colored curves denote the details of synteniregions between VVJAZ.
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.631

【参考文献】