斑马鱼tnni1b基因敲除导致心脏房室瓣膜发育异常的机制研究

发布时间：2020-05-07 16:00

【摘要】：在脊椎动物心脏中,房室瓣膜的正常发育对于心脏正常的形态发生、心房和心室腔室间隔的形成、心脏电生理信号传导网络的形成等都具有关键的作用。在心脏收缩过程中,房室瓣膜的存在可以有效避免血液在心脏腔室之间的回流,维持心脏内的正常血流方向,保证心脏的正常泵血功能。心脏瓣膜发育受损相关疾病在临床上是最常见的先天性心脏病类型。在不同的脊椎动物心脏瓣膜发育过程中,其分子调控机制复杂却相对保守,受到多个信号通路和特异基因的共同调控。心脏收缩功能和血流等表观遗传因素对于心脏房室瓣膜的正常发育也发挥着重要的调控作用。影响心脏瓣膜发育的调控基因、相关信号通路和表观遗传因素等不同调控因子之间如何相互影响还有待深入阐明。发掘和深入研究潜在调控基因和信号通路是如何调控瓣膜发育的细胞和分子进程,探究它们与已知的调控因子之间是否存在相互影响,对于研究脊椎动物心脏瓣膜发育过程,瓣膜发育受损疾病的检测、治疗等具有重要意义。心肌肌钙蛋白I亚基,作为心肌纤维细肌丝上肌钙蛋白复合体的组成成分之一,在心肌收缩过程中发挥着关键的调控作用,其在临床上作为一个高度敏感和特异的外周血检测指标被广泛应用于心肌受损类疾病的检测。心肌肌钙蛋白I在维持心肌正常功能方面具有重要作用,在小鼠等哺乳动物胚胎期和胎儿早期心脏中,主要表达的肌钙蛋白I亚型为慢骨骼肌亚型,随后,心肌肌钙蛋白I亚型会逐渐替换慢骨骼肌亚型,这一替换机制目前尚未研究清楚,使得研究心肌肌钙蛋白I在心脏发育早期的功能变得困难。另一方面,在斑马鱼胚胎期及成鱼心脏中,主要表达的心肌肌钙蛋白I亚型为tnni1b,并不存在哺乳动物心脏中慢骨骼肌亚型向心肌亚型的替换,这使得利用斑马鱼作为实验对象来研究心肌肌钙蛋白I亚型在胚胎心脏发育早期的功能变得可行。本研究利用CRISPR/Cas9技术在斑马鱼体内敲除了tnni1b基因,在纯合突变体胚胎中,观察到显著的心包水肿异常表型,心脏心管环化异常,心脏收缩功能和血流缺失,心跳减弱,心脏心内膜环及房室瓣膜发育受损,在一周左右纯合突变体胚胎中有高达88.8±6.0%的致死率。分子表达水平检测发现,纯合突变体胚胎心脏中,房室瓣膜发育相关的特异基因,如bmp4、cspg2、has2、notch1b、spp1,以及房室管内皮细胞表面特异表达的Alcam蛋白等在房室管形成区域的表达均出现异常,表明突变体胚胎心脏房室瓣膜的发育是在房室管发生阶段就存在异常。在突变体胚胎心肌组织中特异性回补tnni1b基因,可以显著回补心包水肿的异常表型,也可以回补瓣膜发育特异基因的异常表达,进一步证明了tnni1b基因敲除是房室瓣膜发育受损的直接原因。随后,本研究进一步对突变体心脏瓣膜发育受损的分子机制进行了探究。实验结果显示,在纯合突变体胚胎心脏组织中,对瓣膜发育起着重要调控作用的Wnt信号通路被抑制,在大鼠h9c2心肌细胞中敲低心肌肌钙蛋白I,同样能检测到Wnt信号通路受到了抑制,这表明在不同的物种中,心肌肌钙蛋白I对Wnt信号通路的正常激活均具有显著调控作用,并且这种调控作用不依赖于心脏收缩或血流等表观遗传因素。同时,在纯合突变体胚胎心肌组织中,特异性的激活Wnt信号通路可以回补瓣膜发育相关基因的表达异常,进一步证明了tnni1b基因敲除会通过抑制Wnt信号通路影响瓣膜发育相关基因的表达,从而导致心脏房室瓣膜发育受损。综上所述,本研究首次构建并报道了斑马鱼tnni1b基因敲除模型,观察并记录了基因敲除突变体胚胎的表型,发现该基因在斑马鱼胚胎心脏发育早期特别是房室瓣膜发育早期所具有的重要调控作用,揭示了tnni1b基因通过Wnt信号通路参与调控房室瓣膜发育这一信号调控途径。结合体外细胞实验结果,本研究揭示了ctnniWnt这一信号途径对房室瓣膜发育的调控并不依赖于心脏收缩或血流变化等表观因素,这是对于心脏瓣膜发育的分子调控机制研究领域的重要发现。本研究填补了心肌肌钙蛋白I对于胚胎心脏早期发育,特别是瓣膜发育中的功能研究这一领域空白,是对心肌肌节蛋白突变的致病机制研究的重要补充,也为临床上瓣膜发育受损疾病的检测和治疗提供了新的分子靶点和理论参考。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q344

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本文编号：2653205