花斑裸鲤低氧胁迫转录组学及其主要差异基因表达调控研究

发布时间：2020-05-10 14:54

【摘要】：裂腹鱼亚科鱼类是青藏高原鱼类区系中的主体成分之一,而花斑裸鲤是其中的一个代表物种,鉴于花斑裸鲤对高原淡水生态系统中的重要地位以及对高原环境极强的适应性,本研究应用Illumina HiSeqTM 2500技术对花斑裸鲤肝胰脏、肌肉、脑、肾和血液混合组织转录组进行测序、转录本组装和基因功能注释,通过常氧(DO=8.4±0.1 mg/L)和低氧胁迫(DO=3.0±0.1 mg/L)处理比较进行低氧适应相关基因差异表达及其通路富集分析,采用Real-time PCR检测了花斑裸鲤重度低氧和中度低氧处理后差异基因在关键组织中的表达水平,目的在于探讨花斑裸鲤低氧适应的生物学过程和分子机制。主要研究结果如下:(1)通过花斑裸鲤混合组织转录本组装,共获得551 430条转录本,转录本总长达476 992 977 bp,其中有33 7481条unigene序列,大小为221 260 249 bp。序列组装结果满足后续分析的基本要求。(2)对unigenes进行七大数据库的基因功能注释,发现注释最多的是Nt数据库(117 993,34.96%),其次是GO数据库(50 492,14.96%),最少的的KEGG数据库(20 660,6.12%)。Nr数据库注释表明,花斑裸鲤unigenes与斑马鱼的基因有62.1%相似性,此结果与两者都是鲤科鱼类是一致的。(3)花斑裸鲤组织差异表达基因分析结果表明,在低氧条件下肝胰脏、心脏、血液、脑和肌肉组织中分别有28、30、74、60和282个差异基因。差异基因GO富集发现,在低氧条件花斑裸鲤只有3个组织富集到GO条目,其中在脑、肝胰脏组织中主要富集的基因与分子功能有关,肌肉中富集到的与分子功能基因、细胞组分基因和生物学过程基因密切相关。(4)KEGG通路富集表明,血液中11差异基因富集到9个KEGG通路中;脑组织中5个差异基因富集到5个KEGG通路中;肌肉组织中75个差异基因富集到29个KEGG通路中;肝胰脏中13个差异基因富集到10个KEGG通路中。上述结果揭示,花斑裸鲤应对低氧环境将加强糖酵解途径功能和糖异生作用,增强HIF-1信号通路功能,强化抗氧化防御系统,抑制细胞的生长及促进受损细胞的凋亡,从而提高机体的低氧耐受和存活能力。(5)重度和中度低氧条件下,花斑裸鲤HIF-1aA/B和HIF-2αA/B在各组织中的表达模式不尽相同。研究结果表明HIF-1a和HIF-2α的表达水平随低氧程度不同表现为明显的组织特异性,从而提示花斑裸鲤可能存在两种不同的机制分别来应对中度低氧和重度低氧环境。(6)在重度低氧条件下,脑和肌肉组织中EPO mRNA表达显著增加,而在中度低氧条件下,EPO mRNA表达在主要组织中趋于先增加后下降的趋势。此结果表明,花斑裸鲤通过提高EPO的转录水平来增强血液携氧能力,加强了机体的低氧耐受性。同时,通过EPO反馈机制使机体红细胞保持在正常水平,进而使机体在长期低氧环境下生理功能保持正常。(7)在重度低氧条件下,花斑裸鲤通过增强VEGF mRNA的表达促进血管新生和增加血管的通透性来适应短时间的缺氧环境;通过VEGF mRNA系统的负反馈机制调控新血管形成适应长期低氧环境。
【图文】：

S 条带清晰可见，且浓度比值大约为 2:1，说明提取的肝胰脏、脑、心脏、肌和血液组织总 RNA 的完整性良好，基本没有降解；用分光光度计测得 A260280 为 1.8～2.2，表明提取到的 RNA 纯度很高，能够进行后续实验。2 花斑裸鲤转录组测序质量评估通过Illumina HiSeq 2500 双末端测序，30个独立的测序库产生了918 millionired-end reads。经过滤去除接头、不确定碱基和低质量的 1754 million 序列后到高质量测序序列（clean reads）219.12 G 进行后续分析。每个样本的高质量序数范围从 50.9 million（clean bases = 6.36 G）到 69.8 million（clean bases = 8.72），平均大小为 58.5 million。其中对照组中高质量序列为 872.0 million（cleanses = 109.04 G），低氧组中高质量序列为 881.7 million (clean bases = 110.08 G)表 2.2）。对花斑裸鲤常氧和低氧组的血液、脑、心、肌肉和肝胰脏混合转录数据进行碱基分布和测序质量分布检测，发现 GC 含量均在 48%，Q30均在 91%图 2.1），说明测序质量较高。

海大学硕士学位论文 第 2 章 花斑裸鲤低氧胁迫转录组研究3000 202 1448 6230Total897850960871974340109.04 Total939835046881699956110.08注：BL 为血液；HT 为肝胰脏；B 为脑；H 为肾脏；M 为肌肉.3 混合转录本的组装依据常氧组4种组织和血液RNA测序的Illumina reads数据进行了转录本的步组装，共获得 551 430 条转录本，转录本总长达 476 992 977 bp，长度范围 201～34 873 bp，平均长度为 865 bp（图 2.2a）。在拼接结果序列中，共有 33481 条 unigene 序列，，大小为 221 260 249 bp，长度范围为 201～34 873 bp，平长度 656 bp（图 2.2b）。其中小于 300 bp 转录本（55 590）和 unigene（48 839）序列最多。随长度增加转录本与 unigene 数量差距也变大（图 2.2）。
【学位授予单位】：青海大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

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本文编号：2657473