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植物乳杆菌HD-23细菌素基因plnE和plnF的原核表达及抑菌机理研究

发布时间:2020-05-15 20:56
【摘要】:细菌素(Bacteriocin)是由不同种类的细菌通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白质。许多乳酸菌产生的细菌素有非常广泛的抑菌谱,在食品保藏中有很好的应用前景。将细菌素应用在食品工业中可以减少化学防腐剂的添加,减少热处理强度,更自然的保存食物并且丰富其感官和营养特性。本研究中分离得到一株产细菌素且活性强的植物乳杆菌HD-23,优化其发酵培养基;将原核表达得到的细菌素PlnEF用于抑制鼠伤寒沙门氏菌SL1344,研究其基本的抑菌机理;探究PlnEF在鼠伤寒沙门氏菌SL1344细胞膜上可能的细菌素受体,主要结果如下:1产细菌素乳酸菌的分离鉴定从各地采集的自制泡菜水、豆豉、自酿酸奶、腐乳、腊鱼中分离出80株在MRS平板上有明显透明溶钙圈的疑似乳酸菌。复筛采用抑菌试验,对抑菌物质进行生物学特性鉴定后筛选出一株产细菌素活性最强的菌株,分子生物学鉴定后命名为植物乳杆菌HD-23。2响应面优化玉米粉培养基成分玉米作为我国粮食发展的支撑性作物,将其作为培养基成分是对粮食资源的合理利用,并且能降低细菌素生产成本,适应工业上低成本高产量的需求。对玉米粉培养基成分进行响应面优化,抑菌试验以抑菌圈直径为响应值,得到最优的培养基成分为8 g/l玉米粉、3.13 g/l葡萄糖、1.22 g/l蛋白胨、0.57g/l乙酸钠、10 g/l牛肉膏、1 g/l酵母粉、2 g/l柠檬酸氢二铵、0.4 g/l碳酸氢二钾、0.58g/l硫酸镁、0.25 g/l硫酸锰、1 ml/l吐温-80。3细菌素基因plnE和pln F的原核表达及纯化使用同源重组酶的方法诱导载体质粒pET-32a与目的扩增产物重组,重组质粒经两次转化后构建pET-32a-plnE-E.coli BL21和pET-32a-plnF-E.coli BL21表达菌株。经Ni-NTA亲和层析柱,超滤以及肠激酶酶切后获得纯的PlnE肽(3.6 kDa)和PlnF肽(3.7 kDa)。抑菌谱测定显示细菌素PlnEF对革兰氏阳性、阴性菌均有抑菌作用。4细菌素PlnEF作用鼠伤寒沙门氏菌SL1344抑菌机理以纯化后的细菌素PlnEF作用于鼠伤寒沙门氏菌SL1344,测得其细胞裂解率随PlnEF添加量的增加而增加。正常情况下,胞外各物质含量很少,经细菌素处理后发现胞外ATP、乳酸脱氢酶、紫外吸收物质都有明显的增加。结果表明细菌素PlnEF通过使鼠伤寒沙门氏菌SL1344胞内物质泄露,从而导致细胞死亡。5细菌素PlnEF对鼠伤寒沙门氏菌SL1344作用结合位点的研究使用细菌素PlnEF处理鼠伤寒沙门氏菌SL1344,同时提取细菌素处理和未处理的的细胞膜蛋白进行双向电泳,谱图分析电泳图上缺失的蛋白斑点,通过MALDI-TOF-MS测得可能产生影响的蛋白为磷酸甘油酸激酶(PGK)蛋白。用λ-red技术对PGK基因完整的开放阅读框进行敲除,验证细菌素PlnEF可能通过该蛋白对鼠伤寒沙门氏菌SL1344造成影响,使细胞死亡。本论文筛选出一株产细菌素活性较好的植物乳杆菌HD-23,将玉米粉添加至MRS培养基成分中发酵HD-23产细菌素,合理利用粮食资源,符合工业化生产需要。将细菌素基因plnEF同源重组到工程菌中,获得纯的细菌素PlnEF。鼠伤寒沙门氏菌SL1344为全基因组测序菌株,将其作为目标菌,有效的研究了细菌素PlnEF对该菌的抑菌机理是导致胞内物质泄露,从而使细胞死亡。本试验中还探究了PlnEF在鼠伤寒沙门氏菌SL1344细胞膜受影响的为磷酸甘油酸激酶蛋白,并采用基因敲除的方法进行验证。本研究中针对纯细菌素PlnEF的试验为二肽细菌素的深入研究提供了一定的基础。
【图文】:

乳酸菌,个体形态,菌落形态,形态


表 12 PGK 菌落 PCR 扩增体系Table 12 The colony PCR system of PGK反应体系 25.0 μLPGK-jd-f 1.0 μLPGK-jd-r 1.0 μL2 Taq PCR Master Mix 12.5 μLddH2O 10.5 μL与分析菌素乳酸菌的分离鉴定筛中不同发酵样品中共筛选出 80 株疑似乳酸菌。在含有 CaCO3的 MR形态呈圆形,中等大小,凸起,微白色,湿润,边缘整齐,可见明钙圈(见图 3a)。挑菌进行革兰氏染色,在显微镜油镜(1000×)短杆状(见图 3b),为乳酸短杆菌典型形态。

抑菌试验,乳酸菌发酵,金黄色葡萄球菌,上清液


(a) (b)发酵上清液抑菌试验 (a) 大肠杆菌 ATCC 25922,(b) 金黄色葡萄球菌 acterial test of supernatant of lactic acid bacteria (a) E.coli ATCC 25922,ATCC 13565、排过氧化氢干扰-23 菌株发酵上清液中和至 pH 为 7,做抑菌试验后发现中和酸白组几乎相同(见图 5a),图中原始即为 HD-23 菌株未调 pH 明排除酸的作用后仍有抑菌物质的存在,对其进一步确定。清液中加入过氧化氢酶处理,该处理相当于排除过氧化氢干扰现试验组抑菌圈大小与原始组(未处理的 HD-23 菌株发酵上 5b),说明其抑菌现象不是过氧化氢的作用。排酸、排过氧化果的物质不是有机酸或过氧化氢,,对抑菌物质进行蛋白酶敏感
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:TS201.3

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本文编号:2665624

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