苎麻DREB基因鉴定及表达分析

发布时间：2020-05-16 21:27

【摘要】：苎麻是中国重要的天然纤维作物之一。为避免与粮食作物争地,苎麻的种植区域逐渐向条件相对恶劣的山坡地转移。为保障苎麻的纤维产量和品质,进行苎麻抗逆研究十分重要,尤其是抗旱研究。苎麻抗逆相关基因的鉴定、克隆、功能解析及利用等研究,可为苎麻抗逆育种研究提供宝贵的基因资源,为苎麻抗逆分子机制研究奠定基础。转录因子是调控植物应激反应过程的重要参与者,在抗逆研究中有非常广泛的应用。脱水应答元件结合因子DREB基因是AP2/EREBP基因家族的5个亚家族之一,在植物响应多种非生物胁迫过程中发挥重要的调控作用,但其在苎麻抗逆相关基因的研究中还未见报道。本研究以苎麻优质品种“华苎5号”为试验材料,从实验室建立的转录组数据库中获取苎麻DREB基因序列,运用生物信息学分析对苎麻DREB全长基因进行鉴定,利用qRT-PCR技术研究了它们在干旱、高盐、高温、低温等胁迫处理下的苎麻叶片和根系中的表达模式。此外,还克隆了部分苎麻DREB基因并分析序列结构。主要结果如下:(1)从6个转录组数据库中筛选得到了20条具有全长编码序列的苎麻DREB基因,依次命名为BnDREB1-BnDREB20。参照拟南芥和桑树DREB氨基酸序列,对20条BnDREB氨基酸序列进行聚类分析,发现这些序列分别聚在DREB转录因子家族的5个亚组,其中A1亚组8条,A2亚组4条,A4亚组4条,A5亚组2条,A6亚组2条。对BnDREB蛋白序列进行保守元件预测,共检索出10个Motif元件,其中,Motif3和Motif1共同构成了BnDREB蛋白序列的保守结构域;分布在不同亚组中的其余Motif元件则发挥着各自的功能。BnDREB蛋白序列理化性质分析发现,各氨基酸序列长度在184-383之间,分子量在20659.21-42907.60 Da之间,等电点在4.70-10.16之间,表明BnDREB蛋白序列理化性质差异较大;不同亚组之间无明显规律性差异。亚细胞定位预测发现,所有基因均定位在细胞核,有9条基因同时定位在细胞核和细胞质。克隆得到了7条基因,通过绘制内含子-外显子基因结构图发现,只有2条基因分别具有1个内含子,其余均只有1个外显子而无内含子。(2)在干旱、高盐、高温、低温等4种胁迫处理的过程中,苎麻植株的表型变化及响应速度存在差异。BnDREB基因在苎麻叶片和根系中的表达模式不同,几乎所有根系中的基因自胁迫3h至12h都始终显著下调表达,而叶片中基因的表达模式却相当复杂。此外,分析不同亚组间基因的表达规律,发现各亚组基因并不因含有特异性的蛋白序列保守元件而具有不同的表达模式,相同亚组内基因的表达模式也不完全一致,推测苎麻DREB转录因子对非生物胁迫响应过程的调控可能非常复杂。(3)部分基因具有比较特别的表达模式,如BnDREB5在叶片中自低温胁迫3h至12h始终显著下调表达,在根系中却始终显著上调表达,明显异于其他基因在苎麻两个部位中的表达模式;BnDREB19在4种胁迫下的苎麻叶片中均始终显著上调表达;BnDREB11在干旱、高盐、低温等3种胁迫下的苎麻叶片中均始终显著上调表达;BnDREB9、BnDREB10、BnDREB16在高盐、高温、低温等3种胁迫下的苎麻叶片中均始终显著上调表达。这些基因将作为优选基因进行后续研究,以期为苎麻品种的分子改良提供候选基因。
【图文】：

图 1 苎麻水培苗培养过程Fig. 1 Culture process of ramie hydroponic seedling挑取长势良好且一致的苎麻水培苗进行干旱、高盐、高温和低温等 4 种非胁迫，其中，采用 25%（w/v）PEG6000 溶液模拟干旱胁迫，采用 250mm NaCl 溶液模拟高盐胁迫，高温胁迫温度为 40℃，低温胁迫温度为 4℃（吴 2015；廖一文 2016）。每个处理设置三个重复，对照组不做任何处理。以料均分别在胁迫处理 0h、3h、6h、9h、12h 时取叶片和根系，经液氮速冻后-70℃超低温冰箱中保存待用。.5.2 RNA 提取和 cDNA 合成RNA 的提取采用 RNAperp Pure Plant Kit（TransGen Biotech, Beijing, Chi剂盒，用组织细胞碾碎仪磨碎样品后，按试剂盒说明书步骤提取得到苎麻 R

图 2 BnDREB 氨基酸序列的系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree of BnDREB amino acid sequences3.2.2 BnDREB 蛋白序列保守元件分析利用 MEME 工具分析 BnDREB 基因编码的蛋白序列，共搜索到 10 个 Mo元件，结果如图 3 所示。除 BnDREB6 外，Motif1 存在于所有 BnDREB 蛋白列中；除 BnDREB13 外，Motif3 也存在于所有蛋白序列当中。结合 BnDREB 氨基酸序列聚类分析发现，A1 亚组的所有蛋白序列中都含有 Motif4；除 BnDREB1外，A1 亚组的蛋白序列还都含有 Motif2；A2 亚组的蛋白序列都含有 Motif8 Motif9；A4 亚组的蛋白序列都含有 Motif2；A5 亚组的蛋白序列都含有 MotifA6 亚组的蛋白序列都含有 Motif4、Motif6、Motif8、Motif10；可见 Motif 种类数目和分布在相同亚组内保持一致，在不同亚组间则存在差异。此外，，A1 亚的 BnDREB1、BnDREB2、BnDREB14、BnDREB17、BnDREB20 和 A4 亚组
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S563.1

【参考文献】

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本文编号：2667354