结球甘蓝YL-1遗传转化体系的建立及花色基因BolC.cpc-1的功能验证

发布时间：2020-05-17 21:40

【摘要】：结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata)是十字花科芸薹属甘蓝种七个变种之一,是世界范围内重要的经济作物之一。农杆菌介导的甘蓝遗传转化研究始于上世纪80年代,但转化效率低、稳定性差仍是困扰其转化的关键。花色是植物的重要性状,既可作为视觉信号吸引昆虫为其进行授粉,又能保护植物不受伤害。自然界中甘蓝类作物的花色一般为黄色,且花瓣中的主要色素成分为类胡萝卜素。先前已经完成了对甘蓝花色基因BolC.cpc-1的精细定位及候选基因分析。为了验证该基因的功能,本研究构建花色基因BolC.cpc-1的过表达载体pBWA(V)BS-BolC.cpc-1,同时以黄花结球甘蓝自交系YL-1为材料,建立农杆菌介导遗传转化体系。在此基础上,通过农杆菌介导对YL-1进行遗传转化,并对获得的转基因植株进行分子检测、表型观察及BolC.cpc-1基因RT-PCR表达分析。主要结果如下:(1)成功构建了花色基因BolC.cpc-1的过表达载体pBWA(V)BS-BolC.cpc-1。根据已克隆的候选基因BolC.cpc-1序列设计引物,以反转录产物cDNA为模板进行PCR扩增,获得全长为1791 bp的CDS序列。利用内切酶Eco31I对凝胶回收产物和载体进行酶切后,利用一步法同源克隆试剂盒将目的片段连接到空载质粒,获得重组载体pBWA(V)BS-BolC.cpc-1。(2)筛选出高效转化受体材料YL-1,并建立了其转化体系。以四份结球甘蓝自交系下胚轴和具柄子叶为材料,研究基因型对再生频率的影响,结果发现YL-1为最优转化材料。进一步以结球甘蓝自交系YL-1下胚轴和具柄子叶为试材,研究外植体类型、光照强度、苗龄、除草剂浓度、农杆菌侵染浓度、乙酰丁香酮浓度以及共培养温度对不定芽再生的影响。YL-1的具柄子叶和下胚轴再生能力无显著差异,均可以用于遗传转化;光照强度为4000 lx时最有利于YL-1不定芽再生;苗龄5 d时,YL-1下胚轴和具柄子叶的分化再生能力最强;除草剂Baster浓度为8 mg·L~(-1)时,YL-1两种类型的外植体均完全停止分化甚至死亡,因而将该浓度作为最低筛选浓度;农杆菌浓度OD_(600)=0.3时对YL-1侵染8 min,除草剂抗性芽再生频率最高;乙酰丁香酮对YL-1遗传转化的影响作用不大,浓度过高甚至会降低不定芽的再生频率;农杆菌侵染过后将外植体置于共培养温度为25℃的条件下可获得较高再生频率。(3)获得转化BolC.cpc-1基因的植株,并进行了PCR验证。利用构建的过表达载体,基于已建立的遗传转化体系,对结球甘蓝YL-1进行遗传转化,目前共获得47株抗性苗。以载体特异性引物Pboc-1及除草剂标记Bar-2对转基因植株进行PCR扩增检测。结果表明,12株抗性苗为PCR阳性,初步表明该基因已经整合进受体基因组中,转化率达到2.18%。(4)转过表达载体植株的花色由黄变白,验证了BolC.cpc-1基因在花色变异中的功能。花期观察转基因植株的表型,发现花瓣颜色表现出不同程度的变浅,其中一株为完全白色。对转基因阳性植株、受体材料、白花亲本材料花瓣中BolC.cpc-1基因表达情况进行RT-PCR分析,结果显示:BolC.cpc-1在受体材料中不表达,在YF-2中表达量与11-192相近,其余转基因阳性植株中,花色越浅,该基因的表达量越高。由此推测,BolC.cpc-1基因参与调控结球甘蓝花瓣中类胡萝卜素的降解,使得甘蓝花色由黄色转变为白色。
【图文】：

基因,重组质粒,结构示意图

olC.cpc-1 基因 cDNA 的1 Cloning of BolC.cpc-1 g酶切验证(V)BS-ccdb 并转化到大，获得与重组质粒中大，出现符合预期的 21未列出)，表明重组载结构示意图如图 4.3。

酶切图,重组质粒,大肠杆菌,阳性克隆

产物过夜培养后随机挑取单克隆摇菌检测，，获得与重组质粒中大小(2098 bp)一致的条带(图4.2a)。抽提质粒进行酶切验证，出现符合预期的 2161 bp 条带(图 4.2b)，回收测序结果与 cDNA 序列一致(数据未列出)，表明重组载体已构建成功，命名为pBWA(V)BS-BolC.cpc-1。载体结构示意图如图 4.3。200010001791bpM 1
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S635.1

【参考文献】