小麦茎秆快速发育基因qd1的遗传定位与转录组学分析

发布时间：2020-05-18 11:09

【摘要】：小麦茎秆是获得高产和优质的物质基础,但是当前小麦育种利用的茎秆发育调控基因主要为矮秆基因,其遗传基础日益狭窄。诱发突变技术可拓宽小麦的遗传基础,发掘新的调控小麦茎秆发育的优良基因。本实验室前期利用~7Li离子束诱变轮选987(LX987)获得了一个快速发育突变体(qucik development mutant,qd),与野生型相比,qd拔节后的茎秆发育速率和强光诱导下的胚芽鞘颜色表现出明显的表型差异。本研究综合利用BSR-Seq、转录组和660K SNP芯片等技术对控制突变体的茎秆快速发育性状的基因(命名为qd1)以及强光诱导下的花青素合成基因进行初步定位。主要研究结果如下:1、小麦茎秆快速发育基因qd1的初定位。以轮选987×qd的F_2群体为材料,利用BSR-Seq技术在4B染色体上得到一个总长为13.55 Mb的区域,15.41 Mb-28.96 Mb。针对BSR-Seq开发的SNP,在目标区间筛选到了16个KASP(kompetitive allele specifc PCR)标记。在F_2群体的153株隐性单株中,利用这些KASP标记对定位区间进行验证,结果表明与BSR-Seq得到的初定位区间有2.16 Mb的重叠区域(26.80 Mb-28.96 Mb),更进一步缩小qd1初定位区间至5.08 Mb(26.80 Mb-31.88 Mb)。2、野生型与突变体的转录组学分析。KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析表明苯并恶嗪类生物合成通路显著富集差异表达基因。赤霉素合成与信号转导通路中,内根-古巴焦磷酸合成酶(ent-copalyl diphosphate synthase,CPS)和GA20ox出现了差异表达基因的富集。将每种酶对应的所有差异表达基因的表达量FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)值进行加和后,发现在突变体赤霉素合成与信号转导通路中,GA20ox表达量出现大幅下调,推测孕穗期突变体茎秆伸长速率降低可能是由于该时期突变体GA20ox表达量的大幅下降引起的。3、突变体中受强光诱导的花青素合成基因的初定位。利用660K SNP芯片,发现两个F_2群体(轮选987×qd,航麦247×qd)都在7A染色体存在三个一致的多态性SNP富集区。其中260Mb-290 MB区间多态性SNP富集的比例在两个群体中均不低于30%,位于285 Mb处的R2R3-MYB类转录因子最有可能为候选基因。研究表明,综合利用BSR-Seq和660K SNP芯片技术可对控制小麦茎秆发育速率和胚芽鞘花青素合成的关键基因进行快速分析定位。研究结果为拓宽小麦茎秆发育调控基因的遗传资源和深入解析花青素的生理功能奠定了基础。
【图文】：

染色体,测序,数目,亲本

94℃预变性 15 min；（2）94℃变性 20 s，61-55℃退火延伸 1 min（每循环降低 0.6℃），持续 10个循环；（3）94℃变性 20 s，55℃退火延伸 1 min，进行 26 个循环；（4）37℃持续 1 min 后进行荧光采集实现 SNP 基因分型。2.2 结果与分析2.2.1 测序数据与参考基因组的比对以及高质量 SNP 的筛选测序产生出的原始数据去除测序接头、引物序列以及过滤低质量 reads 后，共得到 402.04 Mb双端 reads（对应 118.40 Gb Clean Data）。其中亲本 reads 数目均不低于 25.40 Mb（7.49 Gb），混池 reads 数目均不低于 107.01 Mb（31.53 Gb）。各样品 Q30 碱基百分比均不低于 94.9%，见附表A1。GATK 软件将亲本和混池的 Clean Reads 与参考基因组进行比对后，共发掘出 393,257 个 SNP位点，利用四个标准过滤后，得到高质量 SNP 位点 38,299 个（其中有 692 个 SNP 没有比对到染色体），平均每 380 kb 一个 SNP，每条染色体平均覆盖 1790 个 SNP，见图 2.1。SNP 个数小于 1000的染色体有 2B、2D、3D、4A、4D、5D 和 7D。6B 和 3B 染色体上 SNP 数目最多，分别达到了4299 和 4209 个。4B 染色体上共有 1616 个 SNP，平均每 417 kb 一个 SNP。

染色体,位点,定位区间,赤霉素

对应 Mix-D 的 SNP-index 均值为 0.80。理论上隐性混池目标区间所有 SNP 的 SNP-index 值应为 1，但是混池 Mix-D 在目标区间的最大 SNP-index 值为 0.81，可能是于 QTL 极易受环境或遗传背景的影响致使选择极端矮秆表型时混入了其他基因型的单株。F2群体对 qd1 初定位区间的验证见图 2.3。利用目标区间 SNP 信息开发的 16 个 KASP 标记，对 153 株 F2隐性单株进行筛选，发现了 59 个重组子，其中 31.88 Mb、37.70 Mb 和 41.01 Mb 处，各有一个关键重组子，这三个重组子表明 qd1 位于 26.80 Mb-31.88 Mb 之间，共计 5.08 Mb 区间。这个结果与 QTL-Seq 得到的初定位区间有 2.16 Mb 的重叠区域（26.80 Mb-28.96 Mb），验证了QTL-Seq 得到定位区间的准确性，更进一步缩小 qd1 候选区间至 5.08 Mb（26.80 Mb-31.88 Mb）。实验室前期的研究结果表明 qd 的 Rht-B1 基因的 190 位发生了 T-C 的转换，造成其编码的DELLA 蛋白的终止密码子 TAG 回复突变为编码谷氨酰胺的 CAG，因此 qd 的 DELLA 蛋白恢复为 621 个氨基酸长度，其与赤霉素的互作功能也恢复正常，，表现为对赤霉素敏感（张宁, 2016）。利用 Rht-B1 的 KASP 标记（位于 30.86 Mb）对隐性单株进行验证，结果表明该标记没有重组子（图 2.3），因此 qd1 很有可能位于 Rht-B1a 基因附近。在参考基因组的注释中，qd1 定位区间（26.80Mb-31.88 Mb）包括 Rht-B1a 基因在内，共有 70 个基因，但是并没有与赤霉素的生物合成功能相关的基因，只有两个编码 F-box 蛋白的基因可能与赤霉素的信号转导功能有关。这 70 个基因的详细注释信息见附表 A3。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S512.1

【参考文献】