表达NADPH和底物供应的关键基因对4-羟基异亮氨酸合成的影响

发布时间：2020-05-18 15:38

【摘要】：4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)在胰岛素分泌和胰岛素抵抗方面起重要作用,因此有望应用于糖尿病治疗领域。早期研究中,将编码异亮氨酸双加氧酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)的基因ido在 L-异亮氨酸(L-isoleucine,Ile)生产菌株谷氨酸棒杆菌SN01中过表达,得到菌株SN01/pJYW-4-ido(简称SN02),可实现4-HIL的从头合成。因此本文进一步研究NADPH和底物的供应对4-HIL合成的影响,主要结果如下:1、通过对表达NADPH相关基因或敲除丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的编码基因pknG进行研究,初步探讨了 SN02菌株中4-HIL的合成与NADPH和胞内α-酮戊二酸(2-oxoglutarate,OG)供应的关系:1)过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf构建ido-zwf表达菌SLO1;共表达zwf和NAD+激酶编码基因ppnK构建ido-zwf-ppnK表达菌SL02;过表达酿酒酵母BY4742来源的NADH激酶编码基因POS5构建ido-POS5表达菌SL05。经144 h摇瓶发酵后,SL01和SL02菌株4-HIL产量以及4-HIL和Ile的总浓度均高于对照菌株SN02。说明过表达zwf和过表达zwf-ppnK有利于Ile的积累,对4-HIL合成也有一定的促进作用。但SL05菌株中4-HIL未提高,Ile向4-HIL的转化率仅为53.6%,说明仅过表达POS5不利于4-HIL的合成。2)分别对SL02和SL05菌株进行ΔpknG::ido基因置换,构建SL03和SL06菌株,经144 h摇瓶发酵后,SL03和SL06菌株4-HIL产量较SN02菌株均有所提高,而且SL06菌株中Ile向4-HIL的转化率达到了 98.5%。说明在SL05菌株中通过ΔpknG::ido基因置换来促进OG的供应有利于4-HIL产量的提高。2、通过对能够降低α-酮戊二酸脱氢酶(ODHC)活性编码基因或增加溶氧的基因进行表达,初步探讨了 SN02菌株中4-HIL的合成与OG和氧气供应的关系:为了加强OG的供应并提高溶氧,分别构建过表达ODHC抑制蛋白OdhI的编码基因odhI构建ido-odhI表达菌SL07和过表达odhI与透明颤菌血红蛋白VHb的编码基因vgb构建ido-odhI-vgb表达菌SL08,经144 h摇瓶发酵后,SL07和SL08菌株4-HIL产量分别为41.05±0.77 mmol/L和50.09±4.22 mmol/L,相较于对照菌株SN02并没有明显增加,但SL08菌株中L-谷氨酸、L-丙氨酸和L-赖氨酸(Lys)含量分别降低67.0%、48.4%和37.4%。3、为降低副产物Lys的积累,分别在SN02和SL05菌株中敲除二氨基庚二酸脱氢酶编码基因ddh构建SL09和SLI0菌株。经144 h摇瓶发酵后,SL09和SL10菌株4-HIL产量分别为 63.31±1.50 mmol/L 和25.49±2.51 mmol/L,Lys 产量分别为22.37±0.88 mmol/L和25.80±2.61 mmol/L,相较于对照菌株SN02(28.11±1.72 mmol/L),SL09和SL10菌株中Lys产量分别降低20.4%和8.2%。
【图文】：

酶催化

irnov 等于 2010 年利用分子生物学手段将苏云金芽孢杆菌 2e2 中的 idoEscherichia coli）中过表达，并以外源添加的 Ile、菌株自身合成的α-glutarate, OG）和氧气为底物，经 IDO 催化成功实现一步法合成 4-HIL势在于过表达 ido 后，敲除异柠檬酸脱氢酶激酶编码基因 aceK，使异活性，继续合成 OG，再敲除异柠檬酸裂解酶编码基因 aceA 和α-酮戊基因 sucAB，阻断了琥珀酸的合成，将 4-HIL 的合成与 TCA 循环和菌。补料分批发酵 20 h 后，大肠杆菌 MG1655 2Δ（ΔaceAKΔsucAB）总耗，发现每 100 mmol/L 的 Ile 可转化为 82 mmol/L 的 4-HIL。该团队又于菌代谢途径中的代谢流进行优化，，如阻断 ED 途径，但未影响菌株的戊糖途径后，菌株代谢虽然受到影响，但有更多的碳源进入 TCA 循环20 h 后，发现大肠杆菌 MG1655 2ΔΔ（ΔaceAKΔsucABΔzwfΔeddΔeda） 2Δ菌株少 20.1%，菌体浓度降低了 35.3%，每 200 mmol/L 的 Ile 可转的 4-HIL，最终 Ile 到 4-HIL 的转化率达到了 88.0%[21]。但该方法需要，无疑会使生产成本大大增加，因此寻找一株可自身生产大量 Ile 的菌

反馈抑制,谷氨酸棒杆菌,高丝氨酸,产量

江南大学硕士学位论文步反应合成 Ile 的部分代谢图。如图所示，在 Ile 合并积累中间产物 Thr，会造成合成 Ile 的部分碳流，通过代谢工程改造代谢途径，减少副产物和中间如，在 Ile 合成途径中，Lys 的积累相比较其他杂酸 Lys 合成途径中的二氢吡啶二羧酸合酶的编码基因的产量降低[23]。在 Ile 合成途径中天冬氨酸激酶（A反馈抑制，高丝氨酸脱氢酶（HSD）和高丝氨酸激的反馈抑制[24]。因此提高 Ile 产量常用的手段就是过定点突变技术，达到解除反馈抑制的目的。产量的手段外，NADPH 的供应对于 Ile 的合成是非0 步反应中有 4 步反应需要 NADPH，因此通过提高的产量。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78

【参考文献】