广谱性高效菌株DCE-01关键脱胶酶多基因同源共表达体系构建

发布时间：2020-05-20 05:56

【摘要】：DCE-01是一株“广谱性”、“高效性”脱胶菌,对多种草本纤维原料均能起到很好的脱胶作用,且6.0 h能独立完成苎麻脱胶,不需要其他化学方法后处理补充。其脱胶功能的广谱性和高效性在国内外都属于领先地位。本文以DCE-01菌株为研究对象,从DCE-01菌株中克隆出3个关键脱胶酶基因,以2种不同的排列方式将这3个关键脱胶酶基因串联起来,分别在大肠杆菌和DCE-01菌株中表达,获得结果如下:1.根据全基因组测序注释结果设计特异引物,从DCE-01菌株克隆出关键脱胶酶基因片段3个:果胶酶基因(pelE)、木聚糖酶基因(xyn)及甘露聚糖酶基因(man)。经测序及生物信息学分析:pelE核酸序列长1185 bp,编码395个氨基酸,预测蛋白分子量为43.8 kDa;xyn核酸序列长1251 bp,编码416个氨基酸,预测蛋白分子量45.74 kDa;man核酸序列长1137 bp,编码378个氨基酸,预测蛋白分子量41.85 kDa。2.通过设计特异引物和PCR扩增获得带有特定限制性酶切位点的关键脱胶酶基因(PelE基因、Xyn基因和Man基因)片段,经酶切并与表达载体pET-28a连接,构建成单基因表达重组子,同时,按照PXM、XPM的顺序串联排列在表达载体pET-28a的MCS区段上,构建成多基因共表达重组子,然后,将单基因表达重组子和多基因共表达重组子导入BL21菌株中,成功构建PelE、Man和Xyn的单基因表达重组菌株(pET-28a-P/BL21、p ET-28a-M/BL21和pET-28a-X/BL21)和多基因共表达重组菌株(pET-28a-PXM/BL21和pET-28a-XPM/BL21)。3.将构建的重组子转入到DCE-01(关键脱胶酶基因来源菌株)中,成功获得单基因同源表达的重组菌株3个,包括pET-28a-P/DCE-01、pET-28a-X/DCE-01、pET-28a-M/DCE-01,多基因同源共表达的重组菌株2个,即pET-28a-PXM/DCE-01(或DCE01~(PXM))和pET-28a-XPM/DCE-01(或DCE01~(XPM))。4.对BL21系列重组菌株的酶活测定结果显示:(1)pelE重组菌株所表达PelE酶活为471.97U/mL,而把pelE排列在启动子后面第一位和第二位所形成pET-28a-PXM/BL21和pET-28a-XPM/BL21时,对应的PelE酶活分别是532.68 U/mL和121.43 U/mL。(2)xyn重组菌株所表达Xyn酶活为44.32 U/mL,而把xyn排列在启动子后面第一位和第二位所形成pET-28a-XPM/BL21和pET-28a-PXM/BL21时,对应的Xyn酶活分别是47.43 U/mL和31.42 U/mL。(3)man重组菌株所表达Man达16882.86 U/mL,而将man排在远离启动子位置形成的pET-28a-PXM/BL21与pET-28a-XPM/BL21时,对应的Man酶活分别为645.21 U/mL和230.83U/mL。因此,可以推论:(1)用于构建多基因共表达体系的载体的启动子对pel E的表达效果有显著促进作用;(2)构建多基因共表达体系时,目的基因的表达效果与插入位点离启动子的距离呈负相关,即距离越远效果越差;(3)在多基因共表达体系中,man的表达效果受pelE插入位点的影响突出。5.以DCE-01和DSM18020(模式菌株)为对照,对多基因同源共表达重组菌株纯培养液的酶活测定结果显示:(1)重组菌株DCE01~(PXM)、DCE01~(XPM)的PelE酶活性分别是DCE-01菌株的2.77倍、1.01倍和DSM18020菌株的10.91倍、4.11倍;(2)重组菌株DCE-01~(PXM)、DCE-01~(XPM)的Xyn酶活性分别是DCE-01菌株的1.28倍、1.82倍和DSM18020菌株的5.61倍、8.08倍;(3)重组菌株DCE-01~(PXM)、DCE-01~(XPM)的Man酶活性分别是DCE-01菌株的1.99倍、1.01倍和DSM18020菌株的6.16倍、3.16倍。由此可以得出结论:采用基因串联方法将来自DCE-01菌株的关键脱胶酶基因(pelE、xyn、man)整合到表达载体(pET-28a)中形成重组子,无论是导入原核表达菌株E.coli BL21(DE3)还是导入DCE-01菌株都获得了成功表达,而且多基因同源共表达重组菌株表达PelE、Xyn、Man的酶活都高于DCE-01菌株。6.液相色谱分析DCE-01、DSM18020、DCE-01~(PXM)、DCE-01~(XPM)菌株用于苎麻脱胶发酵液的结果表明:DCE-01~(PXM)菌株的发酵液中检测到的单糖含量要明显高于其他几个菌株,DCE-01~(PXM)菌株发酵液中的单糖含量略高于DCE-01菌株,而DCE-01菌株脱胶发酵液的单糖含量要明显高于DSM18020菌株。这一结果与上述酶活检测结果基本一致,说明将DCE-01关键脱胶酶基因按照PXM的顺序串联排列形成重组子后导入DCE-01中进行多基因同源共表达的方法,能在一定程度上提升DCE-01的脱胶功能。
【图文】：

菌株,基因组DNA,基因组,基因

基因因组 DNA 当作模板，用设计的聚糖酶基因（man）的 PCR 扩增。了明亮、单一的目的条带，在 120elE 片段为 1185 bp、xyn 片段为 1。图 2.1 DCE-01 菌株基因组 DNAFig. 2.1 Genomic DNA of the strain DCD: DCE-01 基因组 DNA; M: DNA m

脱胶酶,片段,条带,关键酶

用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测结果（图2.2）可以看出，扩增出了明亮、单一的目的条带，在 1200 bp 附近，基因片段大小基本与预测结果一致。经测序分析：pelE 片段为 1185 bp、xyn 片段为 1251 bp、man 片段为 1137 bp。初步说明，关键酶基因扩增取得成功。2.3.3 筛选与鉴定重组子将PCR扩增得到的目的基因片段进行加 A尾，再与pMD 19-T进行TA连接，导入E.coli Top10受体，，构建获得重组质粒 pMD 19-T-P、pMD 19-T-X 和 pMD 19-T-M。对阳性克隆进行菌落 PCR，图 3 结果表明：1200 bp 附近出现单一清晰的条带
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78;Q936

【参考文献】