中国水仙类黄酮代谢抑制基因NtMYB2,NtMYB3和NtMYB4的鉴定及功能研究

发布时间：2020-05-21 05:58

【摘要】：中国水仙(iVNaricissus tazetta var.Chinensis)属于石蒜科多年生草本植物,是中国传统著名球根花卉,拥有诱人的花的形状和气味,在世界花卉市场上有重要的经济价值。但是中国水仙很多农艺性状需要被改良,比如说颜色。然而中国水仙是三倍体,主要通过无性繁殖方法进行繁殖,传统的杂交育种方法难以用于遗传改良。基因工程技术的发展使中国水仙品种创新成为可能,改变花瓣颜色可以通过基因工程技术来实现。水仙品种中的黄酮类化合物被发现主要是黄酮醇,没有发现花青素的存在。因此,研究水仙为什么没有花青素生物合成分子机制将会有助于开发多种花色的水仙品种。黄酮类化合物广泛分布在植物体内,包括黄酮,异黄酮,黄酮醇,花青素和原花色素。R2R3-MYB转录因子在黄酮类代谢途径的调控中起着关键作用。本研究从中国水仙克隆出3个R2R3-MYB转录因子NtMYB2、NtMYB3和NtMYB4,并对其功能进行了研究,结果如下。1.利用3' RACE-PCR方法分离到NtMYB2 ORF3'端,进而得到该基因编码区全长序列。NtMYB2 ORF含有783 bp的核苷酸,编码251个氨基酸残基。用RT-PCR方法克隆得到NtMYB3基因编码区全长序列,NtMYB3 ORF全长606bp,编码201个氨基酸。氨基酸序列比对发现,NtMYB2和NtMYB3都属于R2R3-MYB,在R3重复序列中具有与bHLH-相互作用基序[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R和DNEI基序。进一步分析表明NtMYB2和NtMYB3属于R2R3-MYB第4亚组的转录因子,该亚组为R2R3-MYB抑制因子,参与花青素和黄酮类物质的调控。NtMYB2和NtMYB3同第4亚组的其他成员一样,在C端含有C2阻遏基序。系统发育树分析表明,NtMYB2和NtMYB3属于抑制因子的MYB 4-like分支。RT-PCR克隆得到另一个R2R3-MYB基因家族成员NtMYB4的。序列分析表明除R2、R3保守区外,NtMYB4在C-末端显示保守的基序“NF/YWSV/MEDF/LW”,与R2R3-MYB第19亚组基因序列相似。系统发育树分析表明,NtMYB4与花特异R2R3-MYB因子聚为一类。亚细胞定位分析显示NtMYB2、NtMYB3、NtMYB4均为核蛋白。2.研究3个MYB基因在中国水仙不同组织器官以及花发育不同时期的表达,结果表明3个MYB基因有不同的表达形式。NtMYB2基因在中国水仙不同组织中都有表达,但是在花瓣和花冠中的表达量高于叶片和鳞茎盘,并且在芽期的花瓣和副冠中转录水平显著高于半开期以及完全开放期花瓣和花冠;NtMYB3在鳞茎盘中表达水平较高;NtMYB4在花瓣和副冠中的表达量较高,特别是在完全开放时期的花瓣和副冠中表达量较高。3.通过注射烟草叶片进行基因瞬时表达,结果表明阳性对照StMYB单独注射能诱导烟草叶片产生红色,NtMYB2和NtMYB3分别与StMYB混合注射都能完全抑制StMYB诱导产生的红色;NtMYB4与StMYB混合注射也能降低由stMYB诱导生成的红色素,但是其抑制效果比NtMYB2和NtMYB3差。添加StbHLH不会减弱NtMYB2和NtMYB3的抑制效果,但是会降低NtMYB4的抑制效果。定量PCR分析瞬时表达烟草叶片中类黄酮合成途径结构基因的表达,结果表明,StMYB激活了烟草中花青素合成结构基因的表达,而3个MYB基因都能明显抑制花青素合成途径结构基因的表达。4.将3个R2R3-MYB基因构建35S启动子植物表达载体并转化烟草。NtMYB2在烟草中的过量表达显著降低了转基因烟草花的颜色,使烟草花瓣由粉红色变成白色或者淡红色,测定转基因的花瓣中总花青素含量明显低于野生型。除了花的颜色之外,转基因花的大小和长度都比野生型的要小。qRT-PCR分析表明,NtMYB2抑制了烟草类黄酮生物合成途径关键基因的如CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UFGT、ANR和FLS等的转录水平,尤其是UFGT基因。转基因烟草中NtMYB3的过量表达使花色由深粉红色变为几乎白色,NtMYB3转基因花瓣中花青素含量低于野生型。除花色外,转基因烟草还观察到其他一些性状变化,如花的大小和长度均小于野生型。此外,转基因烟草花中柱头的位置高于花药。qPCR结果表明,转基因花瓣中花青素生物合成途径的CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和UFGT等结构基因的表达水平明显下降,黄酮醇分支的重要基因FLS的表达水平也明显下降,而原花青素生物合成分支的ANR和LAR基因在转基因花中的表达水平却上升了。NNtMYB4在烟草中的过表达也改变花的颜色,转基因花瓣颜色变浅甚至变为白色,测定花青素含量表明转基因花瓣中花青素含量明显下降。此外,在转基因的花中还发现花的柱头伸长现象,同时发现NNtMYB4的过表达使部分植株矮化,小花和叶片变窄。qPCR分析表明,NtMYB4转基因烟草花中花青素以及类黄酮生物合成途径结构基因的表达水平均有下降。5.研究结果显示,NtMYB2,NtMYB3和NtMYB4都是类黄酮生物合成途径的抑制因子。NtMYB2可能主要在中国水仙花瓣和副冠抑制类黄酮代谢,包括花青素、黄酮醇和原花青素的合成;NtMYB3可能主要在鳞茎盘上中抑制花青素和黄酮醇的合成,同时激活原花青素的生物合成的激活剂;NtMYB4也是黄酮类物质生物合成的抑制因子,它可能通过与MYB激活因子竞争bHLH的方式在水仙花瓣和副冠中发挥作用。
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S682.21

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本文编号：2673821