蝗绿僵菌GTP酶激活蛋白基因MaGyp2的功能研究

发布时间：2020-05-25 16:47

【摘要】：绿僵菌(Metarhizium)是一类重要的昆虫病原真菌,在生物防治中起到关键的作用。尽管绿僵菌作为生物农药有着许多化学农药无法比拟的优点,如环境污染少、选择性强、具有触杀性等,但是其杀虫速度慢、货架期短、防效不稳定等缺点严重制约了其大规模应用。绿僵菌在田间施用时,其防效和环境逆境如高温、强紫外辐射等因素密切相关。因此研究绿僵菌抗逆机制对提高其防效及稳定性具有重要意义。Rab GTP酶通过在GTP结合的激活态和GDP结合的失活态之间转换起着分子开关的作用,参与多种细胞活动。Rab GTP酶激活蛋白(GAP)是GTP酶活性转换过程中的重要调控因子。目前,关于GTP酶激活蛋白的研究多集中于哺乳动物、酵母和植物病原菌中,而在昆虫病原菌中少有。本研究以昆虫病原真菌蝗绿僵菌(M.acridum)为实验材料。蝗绿僵菌基因组数据分析表明蝗绿僵菌中有11个假定Rab GTP酶激活蛋白,它们均有保守的TBC结构域。本研究选取其中一个假定的Rab GAP蛋白MaGyp2,对其基因进行功能分析。通过同源重组的方法构建MaGyp2的敲除及回复菌株,分析其功能。获得了以下实验结果:1.MaGyp2生物信息学分析根据蝗绿僵菌基因组序列设计引物,克隆得到MaGyp2基因。该基因全长3,461bp,含有2个外显子,cDNA序列全长3,369 bp,编码1,122个氨基酸,其蛋白质分子量为123.8 kDa,等电点为5.43。与酵母中的Gyp氨基酸序列进行比对,发现MaGyp2具有TBC结构域并且含有3个保守的特征基序。2.MaGyp2敲除及回复菌株的获得为了研究蝗绿僵菌MaGyp2的功能,利用同源重组构建了该基因的敲除载体,并在此基础上构建了回复载体。利用农杆菌介导转化蝗绿僵菌,经过抗性筛选、PCR验证筛选以及Southern杂交验证,得到正确的MaGyp2敲除菌株和回复菌株。3.MaGyp2影响菌株对紫外的敏感性野生型菌株(WT)、敲除菌株(ΔMaGyp2)和回复菌株(CP)经紫外照射处理,培养20 h后分别统计其孢子萌发率。结果显示,紫外照射后与WT和CP相比,ΔMaGyp2孢子萌发率显著降低,紫外敏感性显著增强。4.紫外处理诱导MaGyp2上调表达定量PCR分析结果显示,与对照组(紫外照射处理0 h)相比,WT菌株经紫外处理1.5 h、3 h、4.5 h后MaGyp2的表达量显著上升。5.MaGyp2影响菌株抗氧化的能力抗氧化能力分析实验表明,与WT相比,H_2O_2对ΔMaGyp2的抑制效果更加显著,ΔMaGyp2抗氧化能力显著降低。6.MaGyp2影响紫外修复及抗氧化基因的表达利用qRT-PCR技术对紫外相关基因和抗氧化相关基因的转录水平进行检测,结果发现,紫外相关基因Uve1、WC1、Cpb在ΔMaGyp2中表达量降低。紫外处理后,抗氧化相关基因在ΔMaGyp2中下调表达。7.MaGyp2不影响菌株的生长、湿热抗性和毒力等ΔMaGyp2在孢子萌发速率、湿热抗性、毒力等生长、抗性及致病性方面与WT相比无显著差异。8.MaGyp2的缺失诱导Gyp家族其他成员的表达量上调利用qRT-PCR技术,分别检测Gyp家族其他成员在WT与ΔMaGyp2中的表达量。结果显示,Gyp家族其余10个成员中有7个基因在ΔMaGyp2中显著上调表达。
【图文】：

重庆大学硕士学位论文 1 绪 论与菌丝顶端细胞微泡的运输及调节，YPT-1定位于高尔基体，参与高尔基体物质运输，并调节多种分泌途径[64]。Rab蛋白通过在GDP结合的失活态和GTP结合的激活态之间循环行使生物学功能。Rab蛋白失活态和激活态的转化需要GDP解离抑制因子(GDP dissociationinhibitor，GDI)、鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)和GTPase激活蛋白(GTPase activating protein，GAP)等效应子的参与。GDI调控Rab蛋白在膜上的连接和解离，它只与异戊二烯化修饰的无活性Rab蛋白连接，将Rab-GDP保持在胞液中。Rab蛋白和GDI的解离则需要GEF的参与。GEF催化GDP与GTP的交换，一旦Rab蛋白定植在膜上便被GEF激活。激活的Rab通过与上/下游效应器的结合位点与多种蛋白质相互作用，以执行不同的细胞生理功能。当Rab蛋白在膜上完成任务，GAP催化GTP水解，，Rab蛋白失活不再与效应器结合。Rab-GDP在GDI的协助下从膜上解离回到胞质为下一轮循环做准备（图1.1）[53,65-67]。

26图 2.1 MaGyp2 生物信息学分析a. 绿僵菌Gyp家族成员TBC结构域对比，方框显示结构域保守基序。b. 绿僵菌MaGyp2与酿酒酵母同源基因ScMdr1pTBC结构域比对。c. MaGyp2的系统发育树分析。每个节点的数字表示自展值；利用MEGA 6.0软件对MaGyp2进行系统发育树构建分析。Fig. 2.1 Sequence analysis of MaGyp2a. Comparison of the TBC domains sequence of the Gyp family in M. acridum. Red boxe
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S476.12

【参考文献】

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本文编号：2680446