无忧树（Saraca dives Pierre）法尼烯合酶基因克隆与表达

发布时间：2020-05-25 20:37

【摘要】：法尼烯(farnesene)是植物果实和花香的主要挥发成分中的一种倍半萜类次生代谢产物,在化妆品、香料等领域被广泛应用。法尼烯的氢化物法尼烷是一种新型清洁燃料,在生物柴油开发中有巨大潜力。在甲羟戊酸途径(MVA)中,法尼烯合酶(farnesene synthase,FPS)具有将底物法尼烯焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)转化成为法尼烯的作用,是该途径中的限速酶。目前在多种植物中发现FPS,但是无忧树(Saraca dives Pierre)FPS基因有待研究。本文尝试从S.dives中克隆FPS基因完整序列,并进行异源表达及酶活性检测,期望得到S.dives来源的法尼烯合酶基因。利用RT-PCR技术从S.dives成年叶片获得了S.dives的cDNA,并将其克隆到TA载体中。根据其他来源的FPS基因的保守区域设计并合成保守引物,通过PCR技术获得了S.dives FPS基因,经过测序分析表明该基因大小为1593 bp,GC含量为38%,蛋白大小约为58.4KDa。但是与其他物种的FPS序列比较,该基因并不完整,3'与5'端各缺少部分序列以及起始密码子和终止密码子。与香脂树萜烯合酶基因序列同源性为87%。与其他物种的FPS相似度较小,推测可能是由于物种差异所致。为了保证克隆到的ORF结构能表达蛋白,在序列上添加起始密码子ATG和终止密码子TAG后,将该基因序列分别克隆到原核表达载体pCold TF和真核表达载体605ADH1上,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4742中表达,经过SDS-PAGE检测目的蛋白大小与预期大小一致。蛋白与底物FPP反应后经过GC-MS检测,产物为法尼烷(farnesane),该产物是法尼烯的氢化物。推测原因可能有蛋白未经过纯化、由于基因序列不完整导致酶结构和功能发生变化等,后续研究还需要进一步探索。
【图文】：

α-法尼烯的结构式Fig1.1Structureofα-farnesene

β-法尼烯的结构式Fig1.2Structureofβ-farnesenesynthas
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2

【参考文献】

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本文编号：2680711