肢体发育缺陷及胚胎致死相关QTL的精细定位和后肢发育基因表达谱的检测

发布时间：2020-05-26 03:51

【摘要】：哺乳动物的肢体发育涉及细胞增殖、分化、迁徙和凋亡,同源异形盒基因(HOX)、音猬因子(Sonic hedgehog,SHH)、成纤维生长因子(fibroblast growth factor,FGF)和WNT信号通路在其中发挥重要作用。肢体发育初期的肢芽主要由顶外胚层嵴(AER),渐进带(PZ)和极性活化区(ZPA)三部分组成。AER区是肢体生长的主要信号中心,表达一些FGF家族成员基因,如Fgf4和Fgf8。PZ区为AER内侧有着旺盛分裂能力的间质细胞区域,主要由Hoxa基因簇和Hoxd基因簇调控。ZPA区存在于肢芽的后侧,SHH和骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMPs)等基因在其中起到表达调控作用。也有文献报道,肢体发育异常也会并发不孕不育症。由于本实验后肢性状有不完全的外显率,但母体相关的胚胎致死表型十分稳定,因此本实验以胚胎致死的表型为QTL的定位标准。首先,将性状小鼠与C57BL/6品系小鼠杂交,建立F2代同类系小鼠实验动物模型。在8号染色体上的相关区段,选择平均分布的4个SNP位点,再通过使用聚合酶链式反应-连接酶检测法(PCR-LDR)分型技术,对小鼠进行基因分型。通过对相关QTL精细定位后,本实验成功地将之前粗略定位的小鼠8号染色体上的10Mb缩短到2.5Mb(68.3-70.8Mb)。并通过MGI小鼠基因数据库上相关QTL区段的基因信息与小鼠二代测序信息比对,初步筛选出10个候选基因。接着,本实验为研究小鼠胚胎后肢发育阶段(E10.5,E11.5,E12.5,E13.5)相关基因(主要为Hox基因家族)与候选基因的共表达情况,挑选了一个候选基因Pbx4,与Hox基因家族、Wnt5a、Pitx1、Fgf8、Shh等43个与肢体发育相关的基因建立了表达谱,并建立了q PCR array技术手段,用于后续实验的大量候选基因研究工作。首先,选取了Hox基因家族、Wnt5a、Pitx1、Fgf8、Pbx4、Shh等44个与肢体发育相关的基因为检测基因,选取β-actin和Gapdh为看家基因,同时还设置了基因阴性对照组和样品阴性对照组,然后以加热烘干的方法将基因引物固定在PCR板上,加入样品和qPCR反应物,进行实时定量PCR反应。然后,对建立的qPCR array进行了评估工作,通过样品梯度稀释的方法检验了其扩增效率;统计所有表达谱基因的Ct值标准差,评估了该方案的重复性;通过qPCR array的溶解曲线和PCR产物的琼脂糖凝胶电泳证明了该技术手段特异性强的优点。通过已建立的qPCR array检测了C57BL/6(简称B6)品系小鼠胚胎后肢发育时期Hox家族、Wnt5a、Pitx1、Fgf8、Pbx4、Shh等基因的表达差异。以E10.5为对照,检测出在后肢发育时期基因有着两种共表达模式,即Hoxb6、Hoxb8、Hoxc8、Hoxc9、Hoxc10、Hoxd9、Shh、Hoxc9、Hoxc10、Hoxc11、Hoxd9、Hoxd12、Fgf8和Pitx1等基因的相对表达量呈先上调后下调的表达模式;Hoxa11、Hoxa13、Hoxc12、Hoxc13、Hoxd13等基因表达出现下调,候选基因Pbx4的相对表达水平与这种共表达模式相似。另外也有少部分Hox基因在小鼠后肢发育时期表达水平无明显变化。综上所述,本实验第一部分首先对肢体发育缺陷及胚胎致死的小鼠进行了染色体上相关QTL的精细定位,初步筛选了挑选候选基因。第二部分实验为研究小鼠胚胎时期后肢发育相关基因的表达状况,建立了高效稳定、特异性强且重复性好的qPCR array基因检测方案,检测结果描述了在C57BL/6品系小鼠胚胎肢体发育期Hox基因家族、Wnt5a、Pitx1、Fgf8、Pbx4、Shh等基因的相对表达差异,建立了后肢发育基因表达谱,为肢体发育研究工作开辟了新思路,也为之后的研究工作提供了小型数据库,对肢体发育过程中探索Hox基因表达调控网络具有重要意义。
【图文】：

在后肢中形成股骨、胫骨、腓骨、跗骨、跖骨和趾骨[28-30]，如下图1-1b所示。图1-1 前肢和后肢骨骼图1.1.1.1 肢芽的结构与发育在肢体发育研究中，由于操作的简便性，鸡胚成为了早期研究肢体发育的重要对象，主要用来进行相关组织结构的研究和一些移植实验[31-34]。早期对于鸡胚的研究，，使我们认清了肢体发育中细胞间的互作模式和发育过程，为后续的分子学实验打下了研究基础。最近的十多年，在分子生物学领域，由于生物信息学领域的蓬勃发展和实验技术手段不断的更新换代，小鼠和斑马鱼逐渐成为科学家研究肢体发育的主要动物模型[35-39]。

致死相关 QTL 的精细定位和后肢发育基因表达谱的检测4图1-2 肢芽发育阶段基因的表达调控1.1.2 顶外胚层嵴、渐进带和极性活化区的研究现状肢芽的三个信号中心：AER、PZ和ZPA区一直以来都是肢体发育研究领域的研究热点。关于三个信号中心的发育模式，现代科学一直未作出清楚的解释，有两种观点一直争执不下，这两种观点也是现代科学公认的两种主流的肢芽发育模式，即三个信号区共同增厚，共同发育生长；或是三个信号中心似年轮状，逐个发育生长。但无论是哪种生长发育模式，都是要在三个信号中心相互作用、互相调控下，才能完成肢体的正常生长发育[54]。1.1.2.1 顶外胚层嵴的研究进展顶外胚层嵴（AER区）通常被定义为肢体发育末端被增厚的上皮细胞，它覆盖在胚胎外周皮上，环背-腹轴（D-V轴）边界
【学位授予单位】：东华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q344

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本文编号：2681236