基于转录组测序探讨红瓤核桃中花青苷合成的相关调控基因

发布时间：2020-06-02 02:26

【摘要】：本文以红核桃品种资源红瓤核桃和普通绿核桃的叶片和果皮为材料,对叶片和果皮花青苷成分及含量进行了测定;通过比较转录组技术分析了两品种的叶片和果皮在不同发育阶段与花青苷合成的差异表达酶基因与转录因子;并对其进行了验证。主要研究结果如下:1.建立超高效液相色谱-二极管阵列检测器串联质谱(UPLC-PDA-MS/MS)定性和定量检测方法,对不同时期的红瓤核桃和普通绿核桃的叶片及果皮提取物进行了初步分析。结果表明:从‘红瓤核桃’叶片中检测出飞燕草-3-O-半乳糖苷等8种花青苷,不同时期的叶片中花青苷类物质组分和含量差异显著。在红瓤核桃果皮中仅仅检测到飞燕草素-3-O-葡萄糖苷。在普通绿核桃的叶片和果皮中,均未检测到花青苷的存在。2.利用Illumina Hiseq 2500测序平台对红瓤核桃和普通绿核桃叶片、果皮分别进行转录组测序。在叶片中测序获得544,888,472raw reads,基因注释发现,共计30,648条genes(95.98%)得到了功能注释,其中共有19,520条genes映射到GO不同的节点。有17,701条genes被归类到26个COG功能类别中,通过KEGG代谢通路分析发现,7,477条genes参与了242个生物学途径。在果皮中,测序获得423,238,369 raw reads,基因功能注释结果发现,共计29,370条genes(96.47%)得到了功能注释,其中共有19,080条genes映射到GO不同的节点。有17,389条genes被归类到26个COG功能类别中,通过KEGG代谢通路分析发现,7,369条genes参与了242个生物学途径。3.利用表达谱对红瓤核桃花青苷生物合成途径相关基因的表达进行分析,结果表明,在红瓤核桃与普通绿核桃叶片发育过程中,红瓤核桃PAL、4CL、F3H、F3’5’H、DFR、ANS和UFGT基因较绿核桃叶片呈上调表达模式。与此同时,红瓤核桃与普通绿核桃果皮中,红瓤核桃4CL、CHS、F3H、F3’5’H、DFR、ANS和UFGT基因的表达量较绿核桃呈上调表达模式,叶片中编码CHS基因的Jrgene4994和果皮中编码PAL基因的Jrgene11958在绿核桃的转录水平的含量明显高于红瓤核桃,这与其他基因的转录水平模式相反。此外,在叶片中筛选出3个MYB、2个bHLH和2个WD40转录因子,在果皮中筛选出3个MYB、2个bHLH和3个WD40转录因子可能与花青苷的生物合成相关。采用qRT-PCR对叶片中15个酶基因与转录因子和果皮中15个酶基因和转录因子进行了表达验证,结果表明qRT-PCR结果与转录组测序技术结果基本一致。
【图文】：

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图 1 花青苷典型结构示意图Fig.1 Schematic diagram of the structural of anthocyanins1.3 花青苷的提取、纯化和定性定量分析1.3.1 花青苷的提取、纯化植物体中的花青苷往往是最安全，成分最为丰富的，花青苷的获取一般是来自于植物体，化学合成和生物合成也是另外的一种途径。从植物中提取花青苷的常用方法有溶剂提取法、萃取法、超声波辅助提取法和酶解法等方式[18,19]。由于花青苷的结构特性，其在强酸条件下（pH＜3）的结构状态最为稳定。随着溶液的 pH 值增加，花青苷的结构就会发生转化，形成不稳定的甲醇假碱（carbinol base）。因此，在提取花青苷的过程中，应保持溶液的 pH 值一直处在酸性的条件下，从而能够预防花青素的降解。实验目的的不同，用来提取花青苷的方式也不同，最常用的方法是溶剂提取法，溶剂一般为甲醇、乙醇、丙酮、水或其混合溶剂。提取过程中为了防止花青苷的降解，常加入一定浓度的酸性溶液，增强溶液酸性环境。提取溶剂一般为 0.1%盐酸/甲醇体系，适用于多种植物中的花青苷的提取[20,21]。后来有采用 0.1%盐酸/5%甲酸溶液代替甲醇以避免有害物质甲醇的残留[22]。但是一般多用柠檬酸、酒石酸等

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CHS) 、查尔酮异构酶 (chalcone isomerase ， CHI) 和黄烷酮 3- 羟化酶(flavanone3-hydroxylase，F3H)，因 CHS，CHI 是花青苷的启动关键酶，固这一阶段是类黄酮代谢的关键反应，能为花青苷及其它类黄酮类提供前体物质;第三阶段参与的酶有二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol4-reductase，DFR)、类黄酮 3’-羟化酶(flavonoid3’-hydroxylase，F3’H)、类黄酮 3’,5’-羟化酶(flavonoid3’,5’-hydroxylase，F3’5’H)、花青素合成酶(anthocyanidinsynthase，ANS)和类黄酮 3-葡糖基转移酶(flavonoid3-O-glucosyltransferase，3GT)，二氢黄酮醇经过 F3’H 或者 F3’5’H 的催化，会形成相对应的不同的花青苷前体物质，，花青苷类物质的合成途径的分化也就在这个阶段进行分别的合成。在这些酶中 CHS、CHI、F3H 和 F3’H或 F3’5’H 存在于所有黄酮类化合物的合成中，前体物质在这些酶分别的催化下形成对应的相同的物质，这些酶基因是花青苷生物合成的早期结构基因。而自 DFR 到 UFGT 编码的酶催化同一物质却形成了不同的花青苷，称为花青苷特有酶，这些酶基因是花青苷生物合成的晚期结构基因[29]。
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S664.1

【参考文献】