致病疫霉PiGK5基因功能的研究及α1性激素诱导下致病疫霉有性生殖的磷酸化蛋白质组学分析

发布时间：2020-06-02 18:56

【摘要】：由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病被认为是最具破坏性的植物病害之一。致病疫霉可以侵染马铃薯的叶、茎和薯块,迅速摧毁植物,甚至可以在几小时内导致植物死亡,严重危害马铃薯产业的发展。疫霉菌的有性生殖对其物种的演化和延续起着重要作用。疫霉菌的有性生殖是由性激素调控的。A1、A2交配型菌株分别产生α1和α2性激素,当A1和A2交配型菌株共同配对培养时,它们产生的α1和α2性激素分别诱导对方分化出雌、雄配子体,从而完成有性生殖,产生卵孢子。尽管目前α1和α2性激素已经被分离鉴定,然而,关于疫霉菌有性生殖的机理仍未被揭示。本研究以致病疫霉为研究材料,建立了致病疫霉菌株的长期保存方法,绘制了不同菌株的生长曲线以确定其最佳培养时间,并通过不同方法检测了致病疫霉菌株的交配型;克隆了A1交配型菌株HQK8-3 Pi GK5 c DNA蛋白编码区,并进行了序列分析,通过荧光蛋白融合表达技术对Pi GK5蛋白进行了亚细胞定位,通过RNA干扰技术对Pi GK5在致病疫霉无性生殖、有性生殖、致病性等方面的功能进行了研究;通过i TRAQ技术研究α1性激素诱导下致病疫霉A2交配型菌株在不同时间点的差异磷酸化蛋白表达谱,并对差异蛋白表达谱进行了系统的生物信息学分析,筛选出一批潜在地可能与致病疫霉有性生殖密切相关的蛋白。结果表明,本研究中所使用的四种保存方法均能高度保持被测致病疫霉菌株的生存能力,且对菌株的生长和形态特征没有显著影响,但四种保存方法对菌株致病性的影响具有菌株特异性。致病疫霉菌株HQK8-3的最佳培养时间为12天,YF3的为13天,2PO-D的为11天,2PO82001的为9天,USA1的为18天,P7723的为7天。菌株HQK8-3、2PO-D、USA1为A1交配型菌株,菌株2PO82001、P7723为A2交配型菌株,菌株YF3为A1自育型菌株。这些工作为接下来的研究奠定了基础。致病疫霉A1交配型菌株HQK8-3的Pi GK5 c DNA蛋白编码区序列全长2763bp,编码920个氨基酸,与NCBI公布的c DNA序列相似性为99.07%,氨基酸序列相似性为93.42%,菌株HQK8-3的Pi GK5的结构预测结果与NCBI公布的Pi GK5的结构预测结果一致,说明其功能也一致。A1交配型菌株HQK8-3中,Pi GK5在游动孢子中相对表达量最高,其次在休止孢,在营养菌丝、孢子囊和萌发的孢囊中表达量均相对较少。Pi GK5定位于原生质体膜上及细胞内的一些囊泡状结构中。Pi GK5基因参与了A1交配型致病疫霉游动孢子的形成和卵孢子的形成,因此是一个对致病疫霉无性生殖和有性生殖均非常重要的基因,Pi GK5可能是α2性激素的受体。Pi GK5基因参与了A1交配型致病疫霉的致病性,可能是致病疫霉的重要致病因子。通过对α1性激素诱导致病疫霉A2交配型菌株的磷酸化蛋白质组学分析,共得到磷酸化的肽段6355个,鉴定到的蛋白质2508个。One way anova分析显示,在α1性激素组筛选到453个差异磷酸化蛋白质,与对照相比,只在α1性激素组存在的差异磷酸化蛋白有249个。经过在level2水平的GO功能注释及KEGG通路分析,筛选到8个具有显著差异的磷酸化蛋白,包括PITG_01203T0、PITG_06415T0、PITG_07286T0、PITG_07289T0、PITG_10062T0、PITG_19213T0、PITG_19890T0和PITG_22434T0。T Test分析显示,α1性激素处理A2交配型致病疫霉1h、3h、8h、24h,分别筛选到185、43、189、43个差异蛋白质。经过level2水平的GO功能注释及KEGG通路分析,筛选到10个具有显著差异的磷酸化蛋白,包括PITG_00397T0、PITG_00845T0、PITG_01947T0、PITG_04443T0、PITG_04663T0、PITG_07567T0、PITG_10083T0、PITG_12100T0、PITG_16183T0和PITG_17706T0。这18个蛋白极有可能参与致病疫霉有性生殖过程,其功能需要在今后的工作中进一步验证。本研究首次对致病疫霉Pi GK5基因在无性生殖、有性生殖及致病性中的作用进行了研究,并通过磷酸化蛋白质组学方法分析了α1性激素诱导下致病疫霉A2交配型菌株的差异磷酸化蛋白质表达谱,筛选出一批与致病疫霉有性生殖密切相关的蛋白,该工作的完成对未来疫霉菌有性生殖分子机理的揭示及马铃薯晚疫病等植物疫病的有效防治具有比较重要的意义。
【图文】：

晚疫病菌,症状,马铃薯晚疫病,马铃薯植株

图 1 马铃薯晚疫病症状Fig.1 SymptomsofPotatoLateBlightA：马铃薯植株感染晚疫病菌的症状；B：铃薯叶片感染晚疫病菌的症状图；C 和D：马铃薯块茎感染的症状。.2 马铃薯晚疫病的防治目前主要通过使用苯基酰胺类杀菌剂来防治马铃薯晚疫病，，这其中，甲Metalaxyl）是最有效的防治药剂之一。1981 年[40-42,74]，在荷兰和爱尔兰首次马铃薯晚疫病菌对甲霜灵表现出抗药性。随后在欧洲、亚洲、南美洲及北美出现了抗性菌株的报道。1986-1988 年英国的抗性菌株群体由 41%上升至 60%92-1993年[44,74]在美国的15个州中发现有13个州出现了马铃薯晚疫病菌的抗况，1995 年苏格兰有 40%的马铃薯晚疫病菌呈现抗药性[45,74]，而在 1998-2000西则有38%的抗性菌株出现[46,74]。

无性生殖,毁灭性,游动孢子,孢子囊

1.3.2 致病疫霉的无性生殖致病疫霉的无性生殖是造成其毁灭性流行的主要原因。致病疫霉可以产生孢子囊（图2C），孢子囊可以直接萌发产生胚芽管或间接产生游动孢子（图 2D）。游
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.32

【参考文献】