Kiss-1基因抑制胃癌脏器转移的机制研究

发布时间：2020-06-05 08:45

【摘要】：目的:据世界卫生组织(WHO)统计,全球每年新发癌症病例高达900万以上,死亡500万,且有逐年增加趋势。胃癌是常见的恶性肿瘤之一,仅次于肺癌、肝癌居癌症发病率的第三位。我国是胃癌的高发区,发病率占全世界42%,年死亡人数为16万人,近年来中青年人胃癌的发病率呈上升趋势。胃癌确诊时常常进展到中晚期,不仅失去了手术治疗的机会,也增加了放、化疗的难度,预后极差,5年生存率大大降低。胃癌的主要死因是癌细胞的广泛侵袭和转移,特别是难以控制的远隔重要脏器的转移。因此,深入了解胃癌侵袭和转移相关分子机制,寻找敏感、特异的侵袭、转移标志物,对于控制胃癌的远隔脏器转移,提高患者生存期具有重要的临床意义。肿瘤侵袭转移是一个复杂的过程,涉及多个基因质和量的改变。研究表明,肿瘤的转移与肿瘤转移相关基因的激活或转移抑制基因的失活有关。肿瘤转移抑制基因是在分子克隆技术发展的基础上提出的,此类基因在非转移肿瘤中呈高表达,在转移肿瘤中低表达,但不影响肿瘤的发生。Kiss-1基因是近年来发现的一个新的肿瘤转移抑制基因,与多种肿瘤的侵袭和转移相关。kiss-1基因相关肽kisspeptins与受体GPR54结合,抑制多种恶性肿瘤的转移,如人黑色素瘤、膀胱癌、肾癌;卵巢癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌;食管癌、胃癌等。kiss-1基因的表达缺失与上述肿瘤的恶性程度增高、转移能力增强、治疗效果差和预后不良呈正相关。kiss-1基因作为一种肿瘤转移抑制基因,在抑制细胞增殖,增加细胞粘附力,促进凋亡等方面影响肿瘤转移、侵袭能力,这其中涉及多条信号通路并受到诸多因素精细调控,有望成为抗肿瘤转移治疗的新靶点。截至目前,关于kiss-1基因表达与胃癌转移关系的报道尚不多见,其作用机制仍不清楚。本实验分析了TCGA数据库中kiss-1表达与临床病理数据和预后的关系得出kiss-1基因低表达与胃癌脏器转移密切相关这一结论,并利用基因工程技术构建kiss-1基因高表达载体并转染胃癌细胞系,通过体内、外实验全面评估kiss-1基因对胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力的影响,进而揭示kiss-1基因与胃癌侵袭、转移关系及相关机制。研究方法:1分析TCGA数据库中kiss-1表达与临床病理因素及预后的关系1.1从Cancer Genome Atlas(TCGA)(http://www.cbioportal.org/)数据库下载354名胃癌患者的kiss-1mRNA表达量,区分kiss-1低表达与高表达的cut-off值设定为8.85FPKM,使用SPSS软件对临床病理参数和预后进行相关性分析。1.2胃癌组织和胃癌细胞株的收集:选取中国医科大学附属第一医院肿瘤外科手术切除胃癌标本及配对远癌正常胃粘膜标本,共10对,标本离体后尽快取材,置于去RNA酶的Eppendorf管中,-80℃保存备用。收集5种胃癌细胞系BGC823、MGC803、SGC7901、NCI-N87、MKN45,置于去RNA酶的Eppendorf管中,-80℃保存备用。1.3 qRT-PCR方法检测人胃癌组织、配对远癌正常胃粘膜组织和胃癌细胞株kiss-1基因的mRNA,初步评估kiss-1基因在胃癌组织和正常胃粘膜组织的表达水平并筛选kiss-1基因呈低表达的细胞作为转染的候选细胞系。2 Kiss-1基因重组真核表达载体构建、鉴定及稳转胃癌细胞克隆筛选2.1采用PCR技术从前期构建好的质粒中获得kiss-1片段,通过基因克隆技术构建pEGFP-C1-kiss-1重组子,并经双酶切及测序鉴定。采用氯化钙共沉淀法转化大肠杆菌E.coli Competent Cell JM109,小量提取质粒并进行酶切鉴定,最后中等量提取pEGFP-C1-kiss-1质粒,-20℃保存备用。2.2应用Lipofectamin2000转染BGC823胃癌细胞,FCM和G418两种方法双重筛选稳定转染的阳性克隆,分别命名为pEGFP-C1BGC823(BGC823/vector)和pEGFP-kiss-1BGC823(BGC823/kiss-1),经qRT-PCR和Western blot方法检测BGC823胃癌细胞kiss-1基因的表达情况。3 Kiss-1基因对BGC823胃癌细胞生物学特性的影响及其机制研究3.1检测高表达kiss-1基因对BGC823胃癌细胞生物学特性的影响:MTT法连续6天测定BGC823、BGC823/vector和BGC823/kiss-1三组细胞的490nm吸光度值,计算相对增殖率,绘制增殖曲线;FCM检测细胞周期和凋亡的变化;划痕愈合实验和Transwell小室评估kiss-1基因对细胞迁移和侵袭能力的影响;平板克隆形成实验观察kiss-1基因能否抑制细胞克隆形成能力。3.2Western blot方法检测kiss-1基因影响胃癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及血管生成的相关蛋白:ERK1/2/p-ERK、Akt/p-AKT、YAP1、MMP9、VEGF、Sp1和αE-catenin。4 Kiss-1基因对胃癌细胞血行播散脏器转移和裸鼠皮下移植瘤生长的影响及机制研究4.1采用BGC823、BGC823/vector和BGC823/kiss-1胃癌细胞分别建立BALB/C裸小鼠皮下移植瘤模型,每组接种3只裸鼠,共9只;将BGC823/vector对照组和BGC823/kiss-1实验组胃癌细胞分别行尾静脉注射建立裸鼠体内血行播散模型,每组接种3只裸鼠,共6只。4.2每周量取皮下移植瘤大小,连续测量5周,计算瘤体积,绘制移植瘤生长曲线,计算抑制率。裸鼠荷瘤5周处死,完整剥离皮下瘤,称取瘤重。计算成瘤率,比较皮下瘤的体积和瘤重的组间差异。4.3制作裸鼠皮下移植瘤和血行播散模型裸鼠肝脏、肺脏常规石蜡切片,HE染色后观察瘤组织的形态学特点及EGFP表达情况。4.4免疫组织化学方法检测皮下瘤的kiss-1、YAP1、ki67、CD31、VEGF和Sp1的表达。Weidner计数标准检测CD31阳性细胞数用来评判微血管密度(MVD)。荧光显微镜下计数血行播散模型裸鼠肝、肺转移瘤灶(脏器最大横切面),比较组间转移灶数目。5统计分析结果用SPSS for windows 17.0统计软件包进行数据分析。结果:1 Kiss-1基因低表达与脏器远隔转移相关,与正常胃粘膜组织及GES-1相比,人胃癌组织和BGC823胃癌细胞系kiss-1基因表达下调1.1胃癌患者kiss-1基因低表达与脏器远隔转移密切相关(P0.05)。1.2胃癌组织kiss-1基因表达水平低于配对的正常胃粘膜组织(P0.05)。1.3 5种胃癌细胞系BGC823,MGC803,SGC7901,NCI-N87,MKN45中,BGC823细胞kiss-1基因mRNA水平低于其他四种细胞系,选取该细胞系作为kiss-1基因转染的候选细胞系。2成功构建了kiss-1基因重组真核表达载体,转染胃癌细胞并筛选出一株稳定表达kiss-1基因的细胞克隆2.1双酶切及测序鉴定证明成功构建pEGFP-C1-kiss-1真核表达载体。2.2 qRT-PCR和Westernblot方法证实脂质体介导的并经FCM和G418两种方法双重筛选稳定转染的阳性克隆kiss-1基因呈高表达,并命名为BGC823/kiss-1。3 Kiss-1基因在体外可显著抑制BGC823胃癌细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力,诱导G0/G1期阻滞及凋亡,显著下调YAP1、pERK 1/2、pAkt、MMP-9、VEGF和Sp1蛋白表达,上调αE-catenin的表达3.1 MTT法体外增殖实验中,结果显示BGC823/kiss-1实验组胃癌细胞体外增殖能力与BGC823/vector对照组和BGC823对照组相比明显下降,统计学差异非常显著(P0.01)。3.2 FCM测定实验组和对照组胃癌细胞周期结果显示,与BGC823/vector对照组和BGC823对照组相比,BGC823/kiss-1实验组胃癌细胞出现G0/G1阻滞,并且差异非常显著(P0.01)。3.3 FCM检测实验组与对照组癌细胞凋亡水平结果显示,BGC823/kiss-1实验组早期凋亡检出率高于BGC823/vector对照组和BGC823对照组,差异有统计学意义(P0.05)。3.4划痕愈合实验结果显示,BGC823/kiss-1实验组在24h、48h和72h三个时间点的划痕宽度与BGC823/vector对照组和BGC823对照组相比显著缩窄,统计学差异显著(P0.05)。3.5 Transwell小室侵袭实验结果显示,与BGC823/vector对照组和BGC823对照组相比,BGC823/kiss-1实验组穿膜细胞数明显减少,差异有统计学意义(P0.01)。3.6平板克隆形成实验结果显示,与BGC823/vector对照组和BGC823对照组相比较,BGC823/kiss-1组克隆形成率明显减少,统计学差异非常显著(P0.01)。3.7 WB检测结果显示,BGC823/kiss-1实验组总ERK1/2和Akt蛋白表达无明显变化,但磷酸化的p-ERK1/2和p-Akt表达水平下降;YAP1、MMP-9、VEGF及Sp1表达降低,αE-catenin呈高表达。4 Kiss-1基因在体内可显著抑制裸鼠胃癌皮下移植瘤的生长,抑制血行播散胃癌细胞肺、肝转移瘤形成,其机制与下调YAP1、Sp1、VEGF蛋白表达,降低皮下移植瘤微血管密度有关4.1裸鼠皮下荷瘤实验结果显示:对照组与实验组裸鼠荷瘤率均为100%,BGC823/kiss-1实验组组皮下瘤体积和瘤重均小于BGC823/vector对照组和BGC823对照组(P0.05),而BGC823/vector和BGC823两个对照组间皮下瘤体积和瘤重差异不大。4.2皮下瘤免疫组化检测结果显示:BGC823/kiss-1实验组皮下瘤细胞kiss-1蛋白呈阳性表达,BGC823/vector对照组和BGC823对照组皮下瘤细胞kiss-1基因呈阴性表达。BGC823/kiss-1实验组皮下瘤细胞YAP1、SP1和VEGF表达强度显著低于对照组(P0.05)。而对照组的MVD明显高于BGC823/kiss-1实验组(P0.05)。4.3胃癌细胞体内血行播散模型裸鼠肺脏和肝脏转移灶计数结果显示:BGC823/vector对照组的3只裸鼠肺和肝均可见转移灶,肺部生长活跃转移瘤平均为5.5个,最多者见到7个;肝脏可疑微小转移灶平均为4.3个,最多者见到5个。BGC823/kiss-1实验组仅1只鼠肺内发现4个血管内癌栓及肝脏发现2个可疑静脉微小癌栓;其余2只鼠的肺、肝均未见转移。结论:1、TCGA数据库分析kiss-1表达水平与胃癌脏器转移相关。与正常人胃粘膜上皮组织细胞相比较,胃癌组织和BGC823胃癌细胞中,转移抑制基因kiss-1表达显著下调。2、成功构建了稳定高表达kiss-1基因的胃癌细胞株BGC823/kiss-1。3、Kiss-1基因高表达在体外可显著抑制BGC823胃癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力,其机制可能与诱导G0/G1期阻滞和细胞早期凋亡、抑制ERK1/2、PI3K-Akt信号转导通路活性、影响YAP1、αE-catenin、MMP-9等相关分子的生物功能有关。4、Kiss-1基因高表达可显著抑制BGC823胃癌细胞裸小鼠皮下移植瘤的生长,抑制血行播散的BGC823胃癌细胞在裸小鼠体内肺、肝脏转移瘤的形成,其机制除了与诱导G0/G1期阻滞和细胞早期凋亡、抑制ERK1/2、PI3K-Akt信号转导通路活性、影响YAP1、αE-catenin、MMP-9等相关分子的生物功能有关外,还与kiss-1基因下调转录因子Sp1、抑制VEGF转录、进而抑制肿瘤血管生成有关。迄今,关于kiss-1可能通过下调YAP1进而抑制BGC823胃癌细胞血行播散脏器定植转移的研究尚未见报道。
【图文】：

溶解曲线,胃癌组织,基因,生存分析

Kiss-1 基因在人胃癌组织中的表达显著低于正常胃粘膜用 qRT-PCR 方法检测胃癌组织、配对正常胃粘膜组织中的 ki 水平，，由于 kiss-1 基因和内参 GAPDH 的扩增效率不同，采用双析。从溶解曲线可看出，kiss-1 基因的拷贝数不多，很难与 GAP扩增效率，提示正常胃粘膜组织 kiss-1 基因总体表达水平较低，基因表达低于配对正常胃粘膜组织，差异有统计学意义，P=0.03图 1. Kiss-1 低表达胃癌患者生存分析Figure 1. Survival analysis of kiss-1 low expression gastric cancer patients

溶解曲线,生存分析,胃癌组织,基因

3 Kiss-1 基因在人胃癌组织中的表达显著低于正常胃粘膜采用 qRT-PCR 方法检测胃癌组织、配对正常胃粘膜组织中的 kiss-1 基因NA 水平，由于 kiss-1 基因和内参 GAPDH 的扩增效率不同，采用双标曲线法分析。从溶解曲线可看出，kiss-1 基因的拷贝数不多，很难与 GAPDH 达到的扩增效率，提示正常胃粘膜组织 kiss-1 基因总体表达水平较低，胃癌组织s-1 基因表达低于配对正常胃粘膜组织，差异有统计学意义，P=0.038（图 2，2）。图 1. Kiss-1 低表达胃癌患者生存分析Figure 1. Survival analysis of kiss-1 low expression gastric cancer patients
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2

【参考文献】