农杆菌介导小麦遗传转化体系的优化及盐生草耐盐基因在拟南芥中的功能验证

发布时间：2020-06-06 15:38

【摘要】：小麦(Tritieum aestivum L.)是重要的世界性粮食作物,在保障全球粮食安全中占有重要地位。同时,世界范围内的土壤盐渍化危害程度正在不断加剧,由此引发的小麦产量和品质下降等问题日益突出。因此,利用生物工程技术将耐盐基因导入小麦以提高其耐盐性具有广阔的应用前景,而稳定、高效的小麦再生体系是实现基因工程操作的必要条件。盐生植物盐生草(Halogeton glomeratus)主要分布于我国西北旱区和半干旱地区,具有极强的耐盐抗旱性,是发掘耐盐基因的优质物种。本研究以小麦永春2460成熟胚为外植体,构建了稳定高效的小麦再生体系,同时利用农杆菌介导的方法进行遗传转化,并将盐生草中克隆出的耐盐候选基因在拟南芥中进行功能验证,主要结果如下:(1)永春2460小麦成熟胚诱导愈伤组织的外植体最佳处理方法为将种子用30%NaCl O灭菌20 min,用无菌水冲洗干净后浸泡12 h,将小麦胚完整剥下后用刀片破坏胚芽生长点,再用十字切法将胚切成四份后接种于诱导培养基,其愈伤诱导率较高,并能有效防止胚直接发育成幼苗。(2)选用不同激素配比处理对小麦愈伤组织生长体系进行优化,最终确定了较为适宜的愈伤诱导和分化激素配比:2.5 mg/L的2,4-D有利于愈伤组织的诱导,培养体系为MS基本培养基+CH(0.5 g/L)+Pro(0.5 g/L)+2,4-D(2.5 mg/L)+蔗糖(15 g/L)+麦芽糖(15 g/L)+琼脂(4 g/L),pH值为5.6~6.0;愈伤分化体系为MS基本培养基+KT(3.0 mg/L)+6-BA(2.0 mg/L)+蔗糖(15 g/L)+麦芽糖(15 g/L)+琼脂(4 g/L),pH值为5.6~6.0。(3)确定了适用于小麦愈伤组织的遗传转化条件:菌液浓度OD_(600)=0.6,愈伤侵染情况较好且存活率相对较高;头孢霉素浓度为600 mg/L时农杆菌抑菌效果较好,还发现侵染过程中使用超声波处理和加入乙酰丁香酮对于提高其遗传转化效率具有一定的辅助作用。(4)以转化盐生草CL5527基因的拟南芥T_2代为材料,研究该基因对拟南芥耐盐性的影响。结果发现,CL5527基因能明显提高拟南芥的绿芽率,当NaCl胁迫浓度为30 mmol/L和120 mmol/L时,CL5527转基因株系与野生型株系的耐盐性差异较小,在60~90 mmol/L NaCl胁迫时差异显著(P0.05)。根系生长方面:随着NaCl胁迫浓度的增加,野生型和转基因株系的主根生长受到抑制,根长逐渐下降,其中野生型株系主根长度下降幅度较大,转基因株系则相对稳定,二者差异显著(P0.05);同时盐胁迫下拟南芥的侧根数目不断增加,野生型和转基因株系之间差异不显著;表型特征方面:盐胁迫下转基因株系较野生型表现出明显的耐盐优势,在不同NaCl浓度胁迫下转基因株系生长状况均好于野生型;生理生化指标方面:在盐胁迫下转基因株系比野生型的叶片叶绿素含量下降幅度要小,其光合系统破环较轻,对MDA含量及相对电导率等分析发现转基因拟南芥的脂膜受损程度较野生型轻。CL5527基因的表达在一定程度上能够提高拟南芥的耐盐性。
【图文】：

2 个不同基因型小麦在不同的激素配比培养基中表现出一定差异，其中 KT 浓度为 3.0mg/L、6-BA 浓度为 2.0 mg/L 时的分化率最高，在相同的培养条件下，永春 2460 诱导的愈伤组织绿点出现时间要比中麦 175 愈伤绿点时间早2~3 天，并且绿点成苗率相对较高。愈伤诱导 愈伤继代 愈伤分化 愈伤成苗

对愈伤生长的影响代生长状态较好的永春 2460 成熟胚诱导的组织切成两半，作为农杆菌侵染材料。菌液2、OD600=0.4、OD600=0.6、OD600=0.8、OD6组织随着农杆菌侵染液浓度的增大，，褐化为 OD600=0.2、OD600=0.4 时，农杆菌侵染效 0.2 时成活率为 82%，OD600值为 0.4 时存00=0.6 时，侵染效果较好，愈伤成活率为 5OD600=1.0 时，愈伤受损严重，成活率显著图 3-2 农杆菌菌液 PCR 检测Fig3-2. The PCR detection of Agrobacterium tuM: Marker; 1-6:菌液 PCR 产物M: Marker; 1-6: the product of Colony P
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S512.1;Q943.2

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本文编号：2699896