产抗菌肽乳酸菌筛选及抗菌肽PlnF基因的克隆与表达

发布时间：2020-06-09 05:48

【摘要】：在本实验以臭豆腐、辣酱、汤子面等发酵食品为原料筛选乳酸菌,并通过牛津杯扩散法筛选出7株对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌具有抑菌效果的乳酸菌。经16s rRNA鉴定初筛出的7株抑菌菌株分别属于植物乳杆菌、戊糖乳杆菌和副干酪乳杆菌。经蛋白酶K,胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解实验和硫酸铵沉淀实验初步表明7株乳酸菌中抑菌成分属于蛋白类的抗菌肽。且浓缩后T8对于金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌效果则显著增强(13 mm)。大部分菌株抗菌肽耐高温、耐酸且可以溶于醇类物质。而大部分菌株抗菌能力经表面活性剂吐温80处理后显著下降,T4甚至完全失去了抑菌能力。在抑制细菌生长的实验中,培养12 h的3×MRS组实验组中致病菌的OD值和菌落数(10~155 CFU/mL)明显高于单纯致病菌组(10~100 CFU/mL)和3×S6(10~122 CFU/mL),整体而言上清液在起到抑制微生物生长的同时,可能因MRS中存在一定的促菌生长因素。由乳酸菌中提取抗菌肽成本高工艺复杂,而通过基因克隆技术则具有低成本和高产量的特点。所以通过基因筛选技术从筛选出具有抑菌效果的的7株样本中获得了PlnF、PlnE、PlnN、PlnJ、PlnK等抗菌肽基因。在pET28a/BL21(DE3)大肠杆菌表达载体,PlnF、E、K、J和N基因通过PCR技术扩增出两端含有Nco I和Xho I酶切位点的片段,并与pET28a构建重组质粒。经PCR和测序验证构建成功的pET28a-PlnF、E、K、J和N经0.5 mM的IPTG诱导6 h后,离心破碎菌体收集包涵体,8 M对包涵体进行变复性处理之后经Ni柱纯化透析复性后的蛋白经牛津杯扩散法发现,分子量约为5.9 kDa的PlnF纯化蛋白对金黄色葡萄球菌具有13.43±0.21 mm的抑菌圈。而抗菌肽在pET28a载体中表达后,即使经变复性处理后大部分表达蛋白依旧活性不佳。所以在乳酸乳球菌pNZ8149/NZ3900表达载体中,通过Nco I、Sph I和Sph I、Sac I双酶切构建含有usp45信号肽的pNZ8149-usp-PlnF重组质粒。电阻200?、10 KV/cm电场中将重组质粒电击转入NZ3900中,溴甲酚紫筛选培养基、PCR验证、测序等筛选阳性转化子。Nisin诱导6 h后,上清液对金黄色葡萄球菌具有14.03±0.23 mm的抑菌圈。通过Tricin e-SDS-PAGE和nanoLC-ESI-MS/MS分析分子量约6 kDa的目的蛋白与抗菌肽PlnF蛋白相似度高达97.6%,结果证明PlnF抗菌肽基因在结合usp45信号肽基因下可以以胞外分泌的形式在NZ3900/pNZ8149表达载体中正确表达,而且通过原核表达的形式可以有效提高抗菌肽的纯度和提取量,对抗菌肽的应用具有一定的促进作用。
【图文】：

UV1800紫 外分紫紫度计日本青津GL-2 0G离 心机上海安上科学仪器北牛津杯 东超市吉七不东东制品直电垂垂，水平电垂垂，DYY-1 1型 电垂仪北北六一仪器北GeneAmp PCR System 9700 美国 ABI公司JY92- II型 超声型细胞淀碎机宁型新宁生物科技宁宁有ECM399型 电转化仪美国 BTX公司门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型(ATCC 14028)、金黄色葡萄球菌金黄大肠埃希氏菌(ATCC 8739)和蜡样芽胞杆菌(CICC 20551)均购于中国理中心（图 1）。pET28a-DH5α 菌株购自淼灵生物；BL21（DE3北北全日金。149 菌株、NZ3900 菌株，以及分离筛选出的乳酸菌菌株均保藏于吉工程学院食品毒理与安全实验室。

将新合成的引物按照 2.3.1 的反CR 扩增，产物经 2%琼脂糖电垂后按照照爱思质粒小题试剂凝进行提取。组质粒的构建与转化 Xho I 酶切位点的抗菌肽 PCR 产物与 p添加 25 μL 的 PCR 产物/pET28a 质粒，超纯水补足构建 50 μL 双酶切反应体系进行电垂操作后进行凝回收处理。pET28a 质粒能更好的重组，在 10 μL 的连 Buffer，经双酶切的 pET28a 和 PCR 产将混匀的体系置于 16 ℃过夜反应后，，粒转化入宿主菌株内。并涂布在含有 筛选出重组菌株。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TS201.3

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 赵凤亭;程振云;徐莉娟;张傅山;;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的毒力基因检测及研究[J];中国病原生物学杂志;2015年10期

2 赵娜;刘鑫;石和平;乌兰;贺荣;任丽民;;乳酸菌抗菌物质分类及作用机理[J];农产品加工;2015年10期

3 任璐雅;杨艳艳;章检明;易华西;张兰威;;乳酸菌抗菌肽(细菌素)抗菌机理的研究进展[J];中国食品添加剂;2015年01期

4 李娇;董庆利;陆柏益;叶兴乾;刘东红;丁甜;;国内外原料乳中金黄色葡萄球菌风险评估研究综述[J];乳业科学与技术;2015年01期

5 张波;李晨;董慧;寇田田;许文涛;田洪涛;罗云波;;1种快速高效提取乳酸菌质粒的方法[J];中国食品学报;2014年09期

6 李冠楠;夏雪娟;隆耀航;李姣蓉;武婧洁;朱勇;;抗菌肽的研究进展及其应用[J];动物营养学报;2014年01期

7 张永兵;张芹;;高中生物学教材中涉及的常用化学抑菌剂的抑菌原理及应用[J];生物学教学;2013年10期

8 孟庆森;姜艳平;崔文;李海滨;乔薪瑗;葛俊伟;李一经;唐丽杰;;两段牛乳铁蛋白肽基因在乳酸乳球菌中的共表达[J];畜牧与兽医;2013年04期

9 任大勇;李昌;秦艳青;杜寿文;郭欢欢;刘宏锋;洛阳;金宁一;;乳酸乳球菌高效电转化方法的建立[J];中国兽药杂志;2012年01期

10 马淑霞;李丽秋;丁思;任继秋;吴庆田;张昆;杨春佳;崔刚;胡新俊;代月;王春敏;;片球菌素PediocinPA-1抑菌活性检测[J];中国微生态学杂志;2011年09期

相关硕士学位论文 前2条

1 张超;Ⅱa型抗菌肽PCR筛选方法的优化[D];哈尔滨工业大学;2013年

2 方芳;产细菌素乳酸菌的筛选、细菌素的纯化及其特性研究[D];内蒙古农业大学;2008年

本文编号：2704250