慢病毒介导PAQR3基因过表达对胃癌生物学行为及干细胞特性的影响

发布时间：2020-06-12 19:58

【摘要】：目的应用慢病毒法构建PAQR3基因过表达胃癌稳转细胞系。研究PAQR3过表达对胃癌生物学行为的影响。并对PAQR3过表达是否影响胃癌干细胞特性方面进行了初步探讨。方法首先,我们采用基因克隆技术,通过获取PAQR3基因并扩增,基因载体选取与剪切,PAQR3基因与载体连接,重组载体导入感受态细胞和重组DNA的筛选实验过程,构建真核表达质粒PAQR3-CD513。利用PCR实验、双酶切验证和基因测序鉴定重组质粒构建是否正确。将PAQR3-CD513质粒和阴性对照质粒GFP-CD513分别与辅助质粒一起共转染293T细胞,PAQR3、GFP过表达慢病毒分别感染BGC823细胞。荧光显微镜下观察和puro筛选,验证BGC823稳转细胞系是否顺利构建。Western blot实验验证稳转细胞系中PAQR3基因究竟是否顺利表达。在确认稳转细胞系构建成功后,将PAQR3-BGC823稳转细胞命名为PAQR3组(实验组),GFP-BGC823稳转细胞即为对照组。采用MTT法检测PAQR3组和对照组细胞的增殖能力;细胞划痕实验比较PAQR3组和对照组细胞的迁移面积比率;裸鼠皮下注射PAQR3组和对照组细胞后,观察出瘤情况、测量肿瘤大小,计算肿瘤体积。裸鼠处死后剥离肿瘤称重。采用Western blot实验检测PAQR3组和对照组CSC标志物ALDH1A1蛋白的表达。RT-PCR实验检测两组细胞干性相关基因OCT4和SOX2相对表达量。结果1、PCR法克隆并扩增获得PAQR3 DNA分子片段。双酶切产物电泳分析显示1号克隆在与PAQR3 DNA分子大小相一致位置出现明显的阳性条带。1号克隆质粒测序分析,测序可信区域内所涵盖序列与标准序列一致,1号克隆质粒为PAQR3-CD513的阳性重组子。表明重组表达质粒构建成功。PAQR3、GFP过表达慢病毒分别感染BGC823细胞,荧光显微镜下,对照组GFP-BGC823细胞有较强绿色荧光信号,PAQR3-BGC823细胞没有GFP基因,无荧光信号。嘌呤霉素(puro)筛选可以确定PAQR3病毒感染成功。Western blot结果显示,PAQR3-BGC823稳转细胞中PAQR3蛋白表达水平显著高于GFP-BGC823稳转细胞。成功构建慢病毒PAQR3基因过表达稳转细胞系。2、MTT实验结果显示,PAQR3组细胞的生长速度低于对照组(P0.05)。3、细胞划痕实验结果显示:PAQR3组迁移面积比率(0.48±0.013)%小于对照组迁移面积比率(0.63±0.012)%,差异有统计学意义(P0.05)。4、细胞划痕实验结果显示:PAQR3组迁移面积比率(0.48±0.013)%小于对照组迁移面积比率(0.63±0.012)%,差异有统计学意义(P0.05)5、PAQR3过表达组和对照组细胞分别在裸鼠皮下注射,PAQR3组肿瘤的生长速度低于相应对照组,差异有统计学意义(P0.05);剥离出两组瘤体,PAQR3组瘤块整体小于对照组;PAQR3组瘤块重量小于对照组瘤块重量,差异有统计学意义(P0.05)。6、Western Blot结果显示:对照组灰度值为(0.673±0.021),PAQR3组灰度值为(0.582±0.015),差异有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,PAQR3组ALDH1A1蛋白的表达量减少,差别有统计学意义(P0.05)。7、RT-PCR结果显示,与对照组比较,PAQR3组干性相关基因OCT4和SOX2表达量均下降(P0.05)。结论1、成功构建慢病毒介导的PAQR3过表达稳转细胞系。2、PAQR3基因抑制胃癌细胞增殖、迁移及裸鼠成瘤能力,是一种抑癌基因。3、PAQR3基因表达上调减少肿瘤干细胞标志物ALDH1A1的蛋白表达,降低干性相关基因OCT4和SOX2表达。PAQR3基因发挥抑制胃癌干细胞特性作用。可以作为胃癌的靶向基因。
【图文】：

图1-1. pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro质粒图谱主要试剂名称 公司等 培养基 HyeloneGibco胰蛋白酶 HyClone上海生物工程取试剂盒 北京艾德莱试剂盒 TaKaRa剂盒 TaKaRaI TaKaRa TaKaRa

了PAQR3 DNA分子片段（图A），同时对慢病毒表达载体CD513质粒进行BamHI,EcoRI双酶切，线性化的CD513质粒如图B所示，后续经连接转化DH5αE.coli感受态细胞后，次日随机挑取3个单克隆菌落进行扩大培养并提取质粒，再次进行BamHI, EcoRI双酶切处理后，酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，其中1号克隆在与PAQR3 DNA分子大小相一致的位置出现了明显的阳性条带，随即对1号克隆质粒进行测序分析(图1-2.D)，并与标准序列进行比对分析，，结果显示测序可信区域内所涵盖序列与标准序列的相似度为100%（图1-2.E），据此确认1号克隆质粒为PAQR3-CD513的阳性重组子，且序列正确。
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2

【参考文献】

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本文编号：2710035