甜高粱中SSWRKY28、SSWRKY76基因的克隆和功能分析

发布时间：2020-06-16 00:14

【摘要】：水资源愈来愈匮乏导致干旱成为制约植物生长发育的重要因素之一,在这种环境下甜高粱因为其抗旱能力强、生物产量高、含糖量高被作为优质的能源植物重点研究。目前对于甜高粱的研究大多处于生理生化水平,对其分子水平上的研究较少。WRKY(N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列)转录因子参与调节植物生长发育、生物与非生物胁迫应答等多种过程。本文从克隆甜高粱中WRKY基因入手,从分子水平上研究其抗旱机理,为甜高粱抗旱基因的研究打下基础。以甜高粱品种辽甜一号为试验材料,设置0%、10%、20%三个浓度梯度用PEG6000模拟干旱,同时设置12 h、24 h、48 h三个时间梯度。利用巢式PCR技术克隆两个甜高粱WRKY基因全长cDNA,命名为SSWRKY28和SSWRKY76。生物信息学分析结果显示两个基因编码的蛋白均具有WRKY核心序列“WRKYGQK”和“C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H”锌指结构模型。SSWRKY28 cDNA序列全长1179 bp,包括1个1029 bp的开放阅读框,编码342个氨基酸,蛋白分子式为C_(1592)H_(2579)N_(495)O_(499)S_(10),预测其蛋白分子量为36958.61,等电点(PI)为9.38。SSWRKY76 cDNA序列全长1012 bp,包括1个984 bp的开放阅读框,编码327个氨基酸,蛋白分子式为C_(1471)H_(2394)N_(442)O_(501)S_(13)预测其蛋白质分子量为234704.63,等电点(PI)为6.46。疏水性检测两个蛋白都属于亲水性蛋白。序列同源性比较,系统进化树分析表明,SSWRKY28蛋白与高粱、玉米和谷子WRKY蛋白亲缘关系较近,SSWRKY76蛋白与高粱、稷草和玉米WRKY蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,随着干旱胁迫时间延长,甜高粱SSWRKY28和SSWRKY76在0 h到24 h呈下调表达趋势,24 h后到48 h又开始上调表达。由此推测甜高粱基因SSWRKY28和SSWRKY76基因可能在响应应答干旱胁迫时发挥一定的作用。选择SSWRKY28构建重组SSWRKY28::pHBT-GFP拟南芥原生质体表达体系进行蛋白的亚细胞定位分析,激光共聚焦显微镜下进行观察,显示SSWRKY28蛋白定位在了细胞质中,SSWRKY28可能在细胞质内调控植物应答响应干旱胁迫。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S566.5
【图文】：

应答反应,转录因子,信号途径

图 1-1 WRKY 转录因子在非生物胁迫中的应答反应图[35]Fig. 1-1 Response of WRKY transcription factor in abiotic stress[35]RKY 转录因子调控非生物胁迫的机理 WRKY 转录因子涉及各种激素信号网络[36]，受到外源激素子诱导时，能调控信号途径下游基因的表达。其中 WRKY 转录中的一个重要组分，能作为一种转录激活子或转录抑制子加[37]。研究报道 WRKY25 和 WRKY33 在 SA 和 JA 信号调控网并激活 JA 信号途径[38]。活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK），生物中的丝/苏氨酸蛋白激酶，能够将外界信号通过一系列的，在多种信号转导途径中发挥重要作用[39]，在 MAPK 信

保守性,结构域,蛋白,锌指结构

GAGCACAACCACCCGAGCCCGACGCGCGCCGGCGAGCTCCCCAGCGCCE H N H P S P T R A G E L P S AGCCAGCGGGCCCGTGCCGTGCTCAATCTCCATCAACTCCTCCGGCCCGA S G P V P C S I S I N S S G PGACCTCACCAAGAACGGAGGGGGCGGCGGCGTGCGGGTGCTCGACGCCD L T K N G G G G G V R V L D AGACCTCAAGAAGCTGTGCCAGGAGATCGCGTCGCCGGATTTCCGGACGD L K K L C Q E I A S P D F R TCAGATGGCGCGCTCGCTGACCAGCGATTCCAAGTTCACCCACGCGCTGQ M A R S L T S D S K F T H A LCTGCAGCAGCTGCCGGAGTACTAGTGCCTAGCCGTTCCTL Q Q L P E Y 龵图 3-2 SSWRKY76 cDNA 序列及推导的氨基酸序列TG 为起始密码子，TAG 为终止密码子；“WRKYGQK”为 WRKY有的保守结构域，C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H 为锌指结构。RKY76 cDNA sequences and deduced amino acid sequences from doc horizontal line means the initiator codon, TAG means termination code sequence of WRKY, “C-X4-5-C-X22-23-HX1-H” is zinc finger struc

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