赭曲霉培养基筛选及AopacC基因对生长和产毒调控的功能研究

发布时间：2017-03-28 05:02

  本文关键词：赭曲霉培养基筛选及AopacC基因对生长和产毒调控的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是由青霉属和曲霉属产生的次级代谢产物,广泛分布在粮食、水果、饲料、咖啡和动物性副产品中,被国际癌症研究机构(IARC)列为2B类潜在致癌物,严重威胁人类健康和食品安全。有效防控农产品OTA污染的关键是解析OTA合成途径及其合成调控机理。Pac C作为p H调控通路中的关键因子,参与多种生命活动,调控毒素合成,但目前对赭曲霉中Pac C的功能研究尚未见报道。本文研究了赭曲霉在不同培养基上的生长特性和Aopac C基因在赭曲霉p H应答中的作用,研究发现:(1)赭曲霉在不同培养基上产毒差异较大:固体培养基中,赭曲霉在YES培养基上产毒量较高且菌丝发达,OTA达到36.09 ng/mm2培养基,可以用YES培养基来进行赭曲霉生理特性的研究;天然培养基中,OTA产量最高的是玉米渣培养基,OTA产量达到251.67μg/g,可以用来进行OTA毒理和产毒规律等研究;赭曲霉在液体培养基中的产毒十分微弱且只在YES培养基中产毒,OTA产量仅为15.39ppb。此外,研究发现固体培养基上OTA的提取宜采用方便快捷、回收率高的甲醇直接提取法,而在液体中OTA的提取宜选用氯仿萃取法。(2)本研究运用同源重组原理和PEG诱导的方法对赭曲霉Aopac C基因进行敲除:通过PCR扩增获得Aopac C上下游片段和潮霉素片段,采用巢式PCR对三个片段进行融合,将融合目的片段转入赭曲霉原生质体中,通过潮霉素抗性筛选,成功获得赭曲霉3个转化子,经PCR鉴定均为非异位Aopac C突变体,分别命名为:"緼opac C22-1、"緼opac C-3、"緼opac C-5。(3)对Aopac C进行功能分析时发现,"緼opac C与野生型相比,生长缓慢,OTA合成量减少,致病性显著降低,并且呈现出p H依赖性。研究赭曲霉中全局调控基因和基因簇内基因的表达情况时发现,与野生型对比,突变体中的OTA合成簇中的关键基因(Aopks,Aobzip,Aohalogenase)的表达都显著下调,但是全局调控基因的表达在不同p H下表现出差异性,推测Aopac C是通过调控OTA合成相关基因的表达来实现对OTA的调控。此外,本文研究了p H对赭曲霉生长及代谢的影响:p H对赭曲霉孢子产量和菌丝形态没有显著影响,但对其生长、产毒和基因表达都具有调控作用,在p H6条件下赭曲霉生长和产毒均达到最大。
【关键词】：赭曲霉 赭曲霉毒素A 培养条件 PacC 转录因子
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS201.3
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-11
• 第一章 绪论11-28
• 1.1 赭曲霉毒素A研究概述11-13
• 1.1.1 OTA污染及危害11-12
• 1.1.2 OTA的产生条件及防治12-13
• 1.2 p H对微生物的影响13-17
• 1.2.1 p H对微生物生长发育和代谢的影响13-14
• 1.2.2 p H调控通路14-17
• 1.3 Pac C的研究进展17-26
• 1.3.1 Pac C的发现与特性17-18
• 1.3.2 Pac C的结构与三种形式18-21
• 1.3.3 Pac C的功能21-26
• 1.4 本研究内容及意义26-28
• 第二章 赭曲霉培养基的选择及OTA提取方法的探究28-38
• 2.1 引言28
• 2.2 试验试剂与仪器28-30
• 2.2.1 试验菌株28
• 2.2.2 培养基28-29
• 2.2.3 主要试剂29
• 2.2.4 仪器与设备29-30
• 2.3 试验方法30-32
• 2.3.1 赭曲霉在不同培养基上生长和产毒30-31
• 2.3.2 培养基p H的选择31
• 2.3.3 OTA的提取与检测31-32
• 2.4 结果与讨论32-37
• 2.4.1 赭曲霉在不同培养基上生长和产毒32-36
• 2.4.2 p H的确定36-37
• 2.4.3 OTA提取方法的确定37
• 2.5 本章小结37-38
• 第三章 Aopac C突变体的构建38-51
• 3.1 引言38
• 3.2 试验材料与仪器38-41
• 3.2.1 试验菌株38
• 3.2.2 培养基及几种溶液的配制38-39
• 3.2.3 主要试剂39
• 3.2.4 仪器与设备39-41
• 3.3 试验方法41-46
• 3.3.1 基因组DNA提取41
• 3.3.2 上下游片段的获取41-43
• 3.3.3 潮霉素片段的获取43
• 3.3.4 融合片段的获得43-44
• 3.3.5 原生质体的制备44-45
• 3.3.6 转化45
• 3.3.7 转化子验证45-46
• 3.4 结果与讨论46-50
• 3.4.1 Aopac C基因的序列分析46-48
• 3.4.2 突变体的构建48-49
• 3.4.3 转化子验证49-50
• 3.5 本章小结50-51
• 第四章 Aopac C基因在赭曲霉p H应答中的功能研究51-65
• 4.1 引言51
• 4.2 试验材料与仪器51-52
• 4.2.1 试验材料与菌株51
• 4.2.2 主要试剂及培养基51-52
• 4.2.3 仪器与设备52
• 4.3 试验方法52-55
• 4.3.1 Aopac C突变体产毒量分析52
• 4.3.2 生长、产孢及OTA合成的测定52-53
• 4.3.3 菌丝形态的观察53
• 4.3.4 RNA提取及基因表达分析53-54
• 4.3.5 致病性54-55
• 4.4 结果与讨论55-64
• 4.4.1 Aopac C突变体产毒量分析55
• 4.4.2 赭曲霉在不同p H条件下的生长状况55-56
• 4.4.3 赭曲霉在不同p H下的孢子产量56-58
• 4.4.4 赭曲霉在不同p H下的菌丝形态58-59
• 4.4.5 赭曲霉致病性测定59
• 4.4.6 赭曲霉在不同p H下OTA测定59-60
• 4.4.7 基因表达量分析60-64
• 4.5 本章小结64-65
• 第五章 主要结论与展望65-67
• 5.1 主要结论65-66
• 5.2 工作展望66-67
• 参考文献67-81
• 致谢81-83
• 在读学位期间发表的论文83

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