丹参MAPK基因的克隆及表达分析

发布时间：2017-03-28 06:11

  本文关键词：丹参MAPK基因的克隆及表达分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为唇形科鼠尾草属药用植物,其干燥根茎入药,丹酚酸B是其主指标性药用成分之一。植物中的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)能够被多种生物和非生物胁迫诱导,参与植物生长、发育和胁迫应答的信号转导过程。本研究以丹参悬浮培养细胞为材料,用cDNA末端快速扩增技术从丹参中获得一条MAPK基因并对其cDNA和氨基酸序列进行生物信息学分析。用水杨酸、茉莉酸甲酯、过氧化氢、硝普钠、氯化钙、缺钙和氯化钠处理丹参悬浮细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)分析其对丹参MAPK基因表达。用PEG介导法介导绿色荧光蛋白基因转入丹参原生质体,激光共聚焦电子显微镜观察绿色荧光蛋白荧光的位置,分析MAPK的亚细胞定位。构建MAPK过表达和RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体,并用叶盘法侵染丹参叶片得到过表达和沉默植株,研究MAPK在丹酚酸B合成过程中的作用。取得了以下主要研究结果:1、克隆出编码MAPK的基因,得到了cDNA全长,命名为SmMAPK6。SmMAPK6全长1467 bp,含有一个1122 bp的开放阅读框,能够编码373个氨基酸,44 bp的5’-非翻译区和301 bp的3’-非翻译区。2、生物信息学分析预测SmMAPK6编码的蛋白为一个分子量为42.67 kDa、等电点为5.67且不具信号肽、无跨膜结构的亲水性蛋白。属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶大家族,为MAPK蛋白激酶家族TEY亚族成员,有激活位点、ATP结合位点、多肽底物结合位点、A-loop和激酶停泊位点。蛋白序列比对显示与GhMAPK9和GaMAPK3相似性为85%,包含MAPK的11个基本基序,且在第Ⅶ和第Ⅷ个基序间含有TEY基序。系统发育分析显示其为MAPK家族A组成员。3、利用qRT-PCR技术检测SmMAPK6在丹参植株根、茎和叶中的表达量,结果表明SmMAPK6在叶中表达量最高。用不同激素、信号分子和盐处理丹参悬浮培养细胞,结果表明,水杨酸、茉莉酸甲酯、过氧化氢、硝普钠、氯化钙、缺钙和氯化钠都能使SmMAPK6在mRNA水平显著提高,其中H2O2的处理效果最显著。4、PEG介导的绿色荧光蛋白基因转入丹参原生质体,瞬时表达检测结果显示,GFP:SmMAPK6融合蛋白的荧光主要分布在细胞核和细胞质。5、构建了SmMAPK6基因的过表达和RNAi沉默表达载体,为后期研究SmMAPK6在丹酚酸B合成积累中的作用提供基础。
【关键词】：丹参 MAPK 实时定量PCR 亚细胞定位 载体构建
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567.53
【目录】：

• 摘要6-8
• abstract8-13
• 第一章 文献综述13-21
• 1.1 丹参的药用价值及研究现状13
• 1.2 植物MAPK的研究进展13-19
• 1.2.1 MAPK级联途径的基本组成13-14
• 1.2.2 MAPK的结构特点及分类14
• 1.2.3 植物MAPK的功能14-19
• 1.3 选题目的及意义19-21
• 第二章 MAPK基因的克隆及生物信息学分析21-39
• 2.1 材料21-22
• 2.1.1 材料来源21
• 2.1.2 丹参悬浮细胞培养21
• 2.1.3 主要试剂21
• 2.1.4 主要仪器21-22
• 2.2 方法22-30
• 2.2.1 RNA的提取及质量检测22
• 2.2.2 总RNA质量检测22
• 2.2.3 cDNA中间片段的克隆22-25
• 2.2.4 3’-RACE的扩增25-26
• 2.2.5 5’-RACE的扩增26-29
• 2.2.6 丹参MAPK基因ORF序列的扩增29-30
• 2.2.7 生物信息学分析所用软件30
• 2.3 结果与分析30-37
• 2.3.1 丹参MAPK基因全长序列的获得30-31
• 2.3.2 丹参MAPK的生物信息学分析31-37
• 2.4 讨论37-38
• 2.5 小结38-39
• 第三章 丹参MAPK基因的表达分析39-46
• 3.1 材料39
• 3.1.1 材料来源39
• 3.1.2 丹参悬浮细胞的培养39
• 3.1.3 试剂39
• 3.1.4 主要仪器39
• 3.2 方法39-41
• 3.2.1 诱导剂的制备39
• 3.2.2 丹参悬浮细胞的诱导处理39-40
• 3.2.3 MAPK基因表达量的检测40-41
• 3.3 结果与分析41-44
• 3.3.1 SmMAPK6的组织特异性表达分析41
• 3.3.2 SmMAPK6的诱导表达分析41-44
• 3.4 讨论44-45
• 3.5 小结45-46
• 第四章 丹参MAPK的亚细胞定位46-53
• 4.1 材料46
• 4.1.1 植物材料46
• 4.1.2 菌株与质粒46
• 4.1.3 生化试剂46
• 4.1.4 主要仪器46
• 4.2 方法46-49
• 4.2.1 亚细胞定位载体的构建46-48
• 4.2.2 丹参悬浮细胞原生质体的获得48-49
• 4.2.3 PEG融合法转化丹参原生质体49
• 4.2.4 显微镜观察49
• 4.3 结果与分析49-51
• 4.3.1 绿色荧光蛋白融合表达载体pA7-GFP-SmMAPK6的构建49-50
• 4.3.2 重组质粒在丹参细胞中的瞬时表达50-51
• 4.4 讨论51
• 4.5 小结51-53
• 第五章 SmMAPK6过表达载体和RNAi载体的构建及植株转化53-63
• 5.1 材料53
• 5.1.1 植物材料53
• 5.1.2 菌株与质粒53
• 5.1.3 生化试剂53
• 5.1.4 主要仪器53
• 5.2 方法53-58
• 5.2.1 植物总RNA的提取及质量检测53
• 5.2.2 反转录53
• 5.2.3 过表达载体的构建53-55
• 5.2.4 RNAi沉默表达载体的构建55-57
• 5.2.5 农杆菌GV3101感受态的制备57-58
• 5.2.6 叶盘法转染丹参无菌苗及抗性丹参的获得58
• 5.3 结果与分析58-60
• 5.3.1 植物过表达载体的构建58-59
• 5.3.2 植物RNAi载体的构建59-60
• 5.4 讨论60-61
• 5.5 小结61-63
• 参考文献63-71
• 附录71-73
• 缩略词73-75
• 致谢75-77
• 作者简介77

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 赵彦檩;彭龙;赵锦;刘孟军;;枣MAPK基因片段克隆与分析[J];河北农业大学学报;2010年06期

2 ;[J];;年期

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 王庆华;张永生;杨继良;王斌;张举仁;;含有MAPK基因的玉米BAC克隆的筛选和鉴定[A];中国细胞生物学学会第八届会员代表大会暨学术大会论文摘要集[C];2003年

中国硕士学位论文全文数据库 前4条

1 刘俊;丹参MAPK基因的克隆及表达分析[D];西北农林科技大学;2016年

2 郭丽;盐生杜氏藻MAPK基因的克隆及对烟草的转化[D];甘肃农业大学;2006年

3 陈宏宇;高粱MAPK基因家族的识别与分析[D];哈尔滨师范大学;2011年

4 魏从进;桑树MAPK基因家族信息分析与功能研究[D];西南大学;2014年

  本文关键词：丹参MAPK基因的克隆及表达分析，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：271796