CsSAMT-1基因在水杨酸信号响应柑橘黄龙病侵染中的功能研究

发布时间：2020-06-19 11:18

【摘要】：柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是世界性的柑橘检疫性病害,其病原菌为韧皮杆菌属(Liberibacter)的革兰氏阴性细菌,其中亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)是黄龙病的主要致病变种。植物应对病原菌侵染防御机制中关键步骤是通过激活植物局部获得性抗性(Local acquired resistance,LAR)进一步引起系统获得性抗性(Systemic acquired resistance,SAR),这一过程的核心激活信号为水杨酸(Salicylic acid,SA)。植株产生SAR需要SA信号分子的诱导和长距离信号分子水杨酸甲酯(Methyl salicylate,MeSA)的传递,水杨酸羧基甲基转移酶(Salicylic acid carboxyl methyltransferase,SAMT)是SA和MeSA之间转化的关键纽带,能催化SA甲基化为MeSA。有研究表明SA介导的抗性反应在柑橘黄龙病抗性中起着重要作用,但其确切的作用机制未见报道。为了探讨水杨酸信号途径调控柑橘黄龙病抗性的相关机制,本研究以酸柚和锦橙为试材,从症状表现、病原菌生长、寄主解剖结构变化、SA和MeSA水平等方面详细研究了两种柑桔抗性差异的可能原因,结果发现MeSA信号与品种抗性紧密相关,在此基础上,对产生MeSA信号的关键基因CsSAMT-1进行了深入的研究。具体的研究结果如下:1、酸柚和锦橙对黄龙病耐性差异分析对酸柚和锦橙进行黄龙病耐性评价发现,酸柚感染黄龙病后发病所需时间较锦橙长,感病后症状较锦橙轻,显症所需菌量较锦橙多,感病后淀粉粒和胼胝质积累量则少于锦橙,韧皮部加厚程度也明显小于锦橙,结果表明酸柚较锦橙具有一定的黄龙病耐受性。2、酸柚和锦橙感病前后SA、MeSA水平差异利用HPLC-MS/MS法测定感病前后两种物质含量发现,对照组中,酸柚叶脉SA和MeSA含量分别为9.02 ng·g~(-1)(FW)和12.33 ng·g~(-1)(FW),均显著高于锦橙(1.86 ng·g~(-1)和0.04 ng·g~(-1),FW)。感染HLB后,锦橙中SA和MeSA含量均小幅升高,特别是叶脉中SA的含量增加了10.58倍(至19.69 ng·g~(-1),FW);相反,酸柚感染HLB后叶脉SA含量急剧下降(至3.74 ng·g~(-1),FW),MeSA含量则小幅升高(至16.02 ng·g~(-1),FW)。感病后锦橙中MeSA含量虽有一定程度上升(至0.51 ng·g~(-1),FW),但仍远少于酸柚中MeSA含量,且低于酸柚对照中MeSA水平。实验结果表明:耐病酸柚对照中SA和MeSA含量均显著高于易感锦橙,且HLB侵染后锦橙中MeSA的积累仍远低于酸柚。由此推测,酸柚对黄龙病有较高耐受性可能与其体内大量的MeSA有关。3、酸柚和锦橙感病前后CsSAMT-1基因的表达差异定量PCR分析黄龙病侵染后CsSAMT-1基因的相对表达水平发现,与对照植株相比,锦橙在HLB诱导下CsSAMT-1的表达水平明显上升,且在叶脉中相对表达量显著高于叶肉;酸柚在HLB诱导下CsSAMT-1表达水平上升趋势则不明显。进一步分析发现,感染HLB前,酸柚叶肉和叶脉中CsSAMT-1的表达量分别是锦橙的194.56倍和57.16倍;感染HLB后,下降为4.08倍和5.48倍,但仍高于锦橙。结果表明,CsSAMT-1在高感锦橙中受HLB诱导上调表达,在耐病酸柚中CsSAMT-1并不受HLB诱导显著上调,而是呈初始高水平表达,在感病前其表达水平就已显著高于锦橙。由此推测,CsSAMT-1基因的高表达在柑橘对抗黄龙病侵染中有着重要作用。4、外施SA和MeSA诱导酸柚及锦橙CsSAMT-1基因表达分析在SA、MeSA诱导下,锦橙和酸柚中CsSAMT-1基因的表达水平均上调。锦橙在SA、MeSA处理下CsSAMT-1表达水平均于12 h达到最高,酸柚均在处理6 h后达到最高,且6 h时酸柚中CsSAMT-1的表达量高于锦橙。结果表明酸柚响应SA和MeSA诱导CsSAMT-1表达较锦橙早。5、CsSAMT-1基因的克隆和生物信息学分析分别用感染黄龙病的酸柚和锦橙对CsSAMT-1基因进行PCR扩增,测序分析表明该基因的开放阅读框为1 113 bp,编码370个氨基酸,第42-370位氨基酸之间有一典型Methyltransf_7甲基转移酶保守域,以SAM为甲基供体,作用底物之一为水杨酸。其一级结构为亲水性稳定蛋白,进化分析表明与可可、棉花的SAMT亲缘关系较近。6、超量和干扰表达CsSAMT-1的转基因锦橙表型分析以CaMV35S为启动子,构建了CsSAMT-1基因超量表达和RNAi干扰载体,并遗传转化锦橙上胚轴,经GUS染色和PCR鉴定,共得到超表达CsSAMT-1的转基因植株16株,RNAi干扰转基因植株4株。与对照相比,在嫁接成活早期超表达转基因植株的叶形较圆、叶色较绿、叶片较厚,而干扰表达转基因植株则表现为叶色较浅、叶片较厚,但随着植株的生长这种叶色和叶形差异基本消失。对大部分转基因植株叶片的长度和宽度测量分析,结果表明与对照植株无显著差异,而几乎全部转基因植株的叶片显著厚于对照植株。7、转基因锦橙CsSAMT-1基因表达和SA、MeSA水平的分析超量表达CsSAMT-1的转基因植株,基因表达水平较对照植株显著上调,SA和MeSA含量也较对照明显升高,说明CsSAMT-1的超量表达促进了SA向MeSA的正向转化积累,并在非侵染部进一步转化为SA发挥SAR,同时可能激发SA相关合成途径补充大量的SA,使得植株整体保持较高的SA水平。干扰表达CsSAMT-1的转基因锦橙,仅有两个株系基因表达水平下调,但四个株系的SA和MeSA含量均较对照植株明显升高,具体机制有待进一步研究。综上所述,CsSAMT-1基因参与柑橘响应黄龙病侵染的SA信号转导途径,并通过促进SA向MeSA的转化以增强柑橘对黄龙病的耐性。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.66
【图文】：

黄龙病,锦橙,检测结果,柑橘

第 4 章结果与分析第 4 章结果与分析4.1 酸柚和锦橙黄龙病耐性差异分析4.1.1 接种黄龙病后所需发病时间差异于 2015 年 9 月同时对成熟度一致的锦橙和酸柚各接种黄龙病 20 株，三个月后（2015 年 12 月）提取叶脉 DNA 进行 PCR 检测植株感病情况。电泳结果显示，接种的锦橙植株全部检出 HLB 阳性，而酸柚植株则无一检出（图 4.1A、B）。后对酸柚植株每月检测一次，直到 2016 年 9 月（接种 12 个月），有 10 株酸柚检出感染了 HLB（图 4.1 C），且在后续跟踪检测中无新增感病植株。试验结果表明，接种黄龙病后，酸柚较锦橙所需的发病时间长。

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图 4.2 酸柚和锦橙感染黄龙病后表型Fig 4.2 The phenotypic of Sour pomelo and Jincheng after infected HLB图 4.3 显症叶片百分比Fig. 4.3 The percentage of symptomatic leaves in single plant注：* 表示酸柚和锦橙之间差异显著（P ＜0.05）4.1.3 感病后显症所需菌量差异为了探究两种柑橘感染黄龙病后的症状与其体内病原菌含量的的关系，对感

【参考文献】