番茄MADS-box基因SlMBP10的功能研究

发布时间：2020-06-24 22:38

【摘要】：MADS-box家族成员是一类广泛存在于动物、植物和真菌的极其重要的调控因子,MADS-box蛋白都具有保守的MADS-box结构域。植物中MADS-box参与调控众多生长发育过程,比如花器官的形成和果实的成熟等。番茄作为世界上广泛种植的蔬菜作物,番茄的培育需要比较稳定的生长发育条件。然而干旱、高盐等环境胁迫严重影响了番茄的产量与品质。目前,学者对MADS-box基因参与番茄生长发育多集中在花与果实的研究中,然而对MADS-box基因影响番茄非生物胁迫响应的研究相对较少。因此,对此类MADS-box基因在番茄非生物胁迫中的功能研究显得尤为必要。本研究从番茄中克隆出一个MADS-box基因SlMBP10,对其序列进行了生物信息学分析,并构建了该基因的沉默载体,通过农杆菌转化野生型番茄,以期研究番茄SlMBP10的功能。主要研究结果如下:(1)SlMBP10基因的生物信息学分析。本研究从番茄基因组数据库获得SlMBP10的cDNA序列。对SlMBP10编码的氨基酸序列多序列比对和同源进化分析发现,该基因属于MIKC~C型MADS-box家族基因。对SlMBP10开放阅读框上游3000bp启动子序列分析,结果表明SlMBP10启动子序列中含有多个胁迫相关的转录因子结合元件。(2)SlMBP10在野生型番茄不同组织中的表达分析。SlMBP10在营养器官(根、茎、叶)中表达量相对较高,其中茎部表达最高。同时,SlMBP10的激素和胁迫诱导性实验表明,ABA等多种激素均能影响该基因的表达,NaCl和干旱胁迫能够诱导该基因的表达,表明SlMBP10可能与番茄茎的生长发育、NaCl和干旱胁迫的响应有关。(3)SlMBP10转基因番茄材料的获得。根据SlMBP10的mRNA序列,设计特异引物,构建沉默表达载体并转染野生型番茄。通过提取基因组DNA进行PCR阳性鉴定,获得了转基因阳性株系SlMBP10-RNAi。对其表型分析发现,与野生型相比,SlMBP10-RNAi株系的花粉和果实发育等无明显差异,然而SlMBP10-RNAi株系的茎沿茎纵轴方向出现开裂现象。结合上述相关非生物胁迫的表达模式分析,推测SlMBP10可能与非生物胁迫的应答有关,对番茄的营养生长和生殖生长各发育阶段的调控影响并不大。(4)SlMBP10-RNAi株系T1代幼苗对NaCl和干旱抗性分析。对SlMBP10-RNAi幼苗高浓度盐胁迫实验发现,SlMBP10-RNAi幼苗出现比野生型番茄萎蔫更早的表型。同时,与野生型相比,盐胁迫处理后SlMBP10-RNAi株系叶片的叶绿素含量和相对含水量降低,MDA(丙二醛)含量显著性上升,多个胁迫相关基因表达水平均显著低于野生型,叶绿素合成相关基因表达受到影响。干旱胁迫处理SlMBP10-RNAi幼苗发现,SlMBP10-RNAi幼苗的耐受性也比野生型番茄低,MDA含量显著性上升,叶绿素含量、相对含水量以及多个胁迫相关基因表达水平均低于野生型,叶绿素合成相关基因表达受到影响。盐水浸泡转基因植株叶片实验表明,SlMBP10-RNAi株系叶片叶绿素含量低于野生型。此外,NaCl敏感性实验发现盐处理对SlMBP10-RNAi株系幼苗生长的抑制作用更明显。这些结果表明降低SlMBP10的表达水平可以减弱番茄抗盐抗旱的能力。(5)SlMBP10-RNAi转基因幼苗对三种激素的敏感性分析。ABA、IAA和GA_3的敏感性实验发现,ABA处理SlMBP10-RNAi和野生型幼苗后,转基因幼苗的胚轴和根长均比野生型的减短。IAA、GA_3处理SlMBP10-RNAi和野生型幼苗后,转基因幼苗胚轴和根长与野生型相比没有明显的差异。结果表明沉默SlMBP10基因提高了番茄幼苗对ABA的敏感性,而对IAA和GA_3的敏感性没有明显的影响。综上所述,本研究从番茄中克隆了SlMBP10基因并对其在番茄幼苗非生物胁迫响应方面进行了初步的探索,为全面阐明SlMBP10基因的功能和其对非生物胁迫响应的分子机理奠定基础。
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S641.2
【图文】：

蛋白结构,结构域,MADS-box基因,氨基酸组成

图1.1 MADS-box蛋白结构和分类[42 44]Fig.1.1 Classification and structure of MADS-box proteins[42 44]MIKC型MADS-box基因的结构中主要包含四个结构域：M（MADS-boN端的MADS-box结构域，是MADS-box基因中最保守的部分，由50-60个基组成的，主要起与靶基因DNA结合的作用[45]，I（Intervening）即MAD域下游区域的I结构域，是由31-35个亲水氨基酸组成，它与MADS-box结行使蛋白质二聚化的功能[46]，K（Keratin-like）结构域是植物中MADS-特有结构域，由大约70个氨基酸组成的含有3个α-螺旋结构的次级保守结参与蛋白与蛋白之间的相互作用[47]，C末端的C结构域（C-terminal）主要变化的疏水氨基酸组成，介导特异的MADS-box蛋白发挥不同的作用[48 5。MIKC型基因又可以分为MIKC*型和MIKCC型，两者在I结构域存在差为止，对于MIKC*型MADS-box基因的研究尚不清楚，而MIKCC型基S-box基因家族中功能研究相对较清楚的，在植物的生长发育整个过程中作用。

植物,分生组织,基因

1 绪论5图1.2 植物MIKC类MADS-box蛋白的结构[51]Fig.1.2 Domain structure of MIKC-type plant MADS-box protein[51]1.2.4 MADS-box 基因的功能MADS-box 转录因子在植物的所有器官的形态发生及植物生长发育的整个过程都有很重要的作用，例如根和叶片的生长[52]，花分生组织发育和控制开花时间[53]，花器官的发育[54]，果实成熟[55]，种子色素积累和胚胎发育以及对植物非生物胁迫的调控[56,57]。本节将对 MADS-box 基因在植物中的主要功能进行介绍：① 调控植物的营养生长目前已有研究表明 MADS-box 基因参与调控植物的营养生长。如 Tapia-Lopez等人[58]发现拟南芥 XAL1 基因的突变导致植株根的生长受到了抑制且有色素积累，根尖分生组织出现异常，细胞的扩增速度变慢。水稻 OsMDP1 基因会受到外源油菜素内酯的抑制和黑暗的诱导而改变其转录水平

【参考文献】