水稻灌浆期耐热性关键候选基因的筛选及CRISPR载体构建

发布时间：2020-06-26 21:33

【摘要】：全球气候变暖、夏季频繁出现的高温天气(尤其是夜间高温)造成水稻减产和稻米品质下降,威胁我国粮食安全,因而探究水稻耐热的分子机理、选育耐热水稻优良品种刻不容缓。本研究应用RNA-Seq和全长转录本PacBio测序,从基因转录水平上分析了水稻应答灌浆期夜间高温的基因表达模式;利用iTRAQ蛋白标记技术和液相质谱鉴定技术,从蛋白质组水平上鉴定了水稻应答灌浆期夜间高温的差异表达蛋白;进而通过基因在转录水平和蛋白质水平的表达模式联合分析,确定了与信号传导相关基因Os05g0585500(LOC_Os05g50810)是参与调控水稻灌浆期耐夜间高温的关键候选基因。进一步对这一关键候选基因进行序列比对、靶位点设计,构建了携带LOC_Os05g50810基因靶位点的特异性CRISPR/Cas9表达载体。取得的主要研究结果如下:(1)RNA-seq分析和PacBio的全长转录本测序获得26,327个全长转录本的序列及它们的表达模式,利用iTRAQ蛋白标记技术和液相质谱鉴定技术鉴定了3,130个蛋白质及其表达丰度。表达模式分析显示,耐热纯系和热敏感纯系之间存在差异表达倍数大于1.5倍的转录本有10,996个,耐热纯系和热敏感纯系间存在差异表达倍数大于1.5倍的蛋白质有70个。(2)源于蛋白质组分析结果的上述70个差异表达基因的功能主要涉及光合作用、生物合成、转录调控、防御反应、逆境应答、能量代谢、物质转运、氧化还原、信号传导。进一步通过基因在转录水平和蛋白质水平的表达模式的联合分析,发现了一个钙依赖的信号传导蛋白基因LOC_Os05g50810,该基因在耐热纯系和热敏感纯系间的(mRNA)差异表达倍数仅0.97倍,而其编码蛋白的差异表达倍数达1.93倍,表明转录组中微小的变化导致蛋白质组显著变化。在钙依赖的信号传导蛋白中,该基因编码蛋白在耐热纯系和热敏感纯系间的差异表达水平最高,结合前人研究结果,故而确定参与Ca~(2+)依赖的信号传导的基因LOC_Os05g50810为调控水稻灌浆期耐夜间高温的关键候选基因。(3)根据测序获得的全长转录本序列及其数据库比对结果,设计基因靶位点,构建了携带LOC_Os05g50810基因靶位点的特异性CRISPR/Cas9表达载体,为继续进行遗传转化、打靶效率检测、候选基因的生物学功能验证奠定了研究基础。
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511
【图文】：

转录本,蛋白质,库搜索,数据库搜索

high）的肽段，其中，可用于蛋白定量的特异肽段为 12,911段经 Uniport 数据库搜索，最终鉴定了 3,130 个蛋白质。D 和蛋白 ID 的匹配及其定量分析长转录本序列比对到数据库后获得 26,327 个转录本；蛋白质肽段和特异肽段经数据库搜索后鉴定了 3,130 个蛋白质。根据质组共匹配上了 2,085 个基因的 ID，仍有 24,242 个转录本的能蛋白质 ID，有 1,045 个蛋白质没有匹配上相应的转录本 ID（

差异表达,高温处理,转录本,常温

有 1,045 个蛋白质没有匹配上相应的转录本图 2.1 检测到的全长转录本数量和功能蛋白数量及其交集umber of full-length transcripts and functional proteins detected and达量经 FPKM 值转换后，进一步分析高温处理和常温表明：耐热纯系的高温处理与常温对照之间差异表达倍本；热敏感纯系的高温处理与常温对照之间差异表达录本。蛋白质 iTRAQ 标记与分析检测到的 3,130 个蛋与常温对照之间差异表达倍数超过 1.5 倍的有 63 个蛋与常温对照之间差异表达倍数超过 1.5 倍的仅有 38 个蛋

【参考文献】