水稻OsPPDK基因载体构建及与持绿性状的相关性研究

发布时间：2020-06-27 03:35

【摘要】：持绿性指植物生长后期叶片衰老或黄化延缓而保持绿色的特性,与植物抗衰老、抗生物及非生物胁迫、增加产量等密切相关,被认为是作物的理想农艺性状。对功能性持绿基因的研究与利用是解决杂交水稻早衰、突破水稻现有生产力的一条可行的技术路径。本研究以早衰籼稻金23B和持绿籼稻R287为材料,利用生物信息学、基因工程以及分子生物学的方法,对水稻持绿性候选基因OsPPDK基因进行克隆。通过荧光定量PCR分析在水稻生长后期OsPPDK基因的表达差异,并测定了不同N浓度处理下不同部位OsPPDK基因的表达量。同时成功构建了 ds1301-OsPPDK RNAi载体和pU1300-OsPPDK超表达载体,将构建完成的表达载体转入金23B和R287中,并测定转基因植株OsPPDK基因的表达量。获得的实验结果如下:1、根据NCBI数据库的TaNAM基因设计引物,成功从金23B叶片cDNA中PCR扩增获得水稻OsPPDK序列。通过测序结果可知目标片段长为2844bp,对该序列进行生物信息学分析,发现水稻OsPPDK基因编码947个氨基酸,翻译的蛋白是稳定的酸性亲水性蛋白,位于细胞质中,为胞质型PPDK(cyPPDK),其蛋白二级结构主要由α-螺旋、β-转角、无规则卷曲及延伸链四种结构组成,且该蛋白不具备跨膜结构和信号肽。2、通过荧光定量PCR分析金23B和R287抽穗期、灌浆期、乳熟期和蜡熟期OsPPDK在不同组织部位(叶片和叶鞘)的表达量情况,发现OsPPDK在金23B和R287的四个时期均有表达。在叶片和叶鞘中,抽穗期和灌浆期表达量较低;而在乳熟期和蜡熟期表达量相对较高,表达情况则存在较大差异,在乳熟期,R287叶片中OsPPDK的表达量是金23B的2.32倍,而在叶鞘中则为1.48倍;而在蜡熟期,金23B叶片的OsPPDK的表达量是R287的7.34倍,而在叶鞘中,其表达量则无明显差异。3、根据对OsPPDK基因进行结构域分析结果显示,发现OsPPDK基因具有3个N元素结合域,因此对金23B和R287幼苗进行不同氮浓度处理。测定OsPPDK在不同组织部位的表达量情况。荧光定量PCR结果表明,OsPPDK基因在不同氮浓度生长的叶片中均有表达,其中金23B中OsPPDK表达量普遍高于R287。两个品种间在叶片和根中,OsPPDK表达量随着氮浓度的升高而增加,但表达差异却相反,在叶中1/2氮浓度下,金23B的表达量为R287的2.86倍,而在2倍浓度下,基本表达量相当;而在根中,则相反,在1/2氮浓度下,表达量最低且相当,在2倍浓度下表达差异最大,金23B的表达量是R287的4.63倍。说明OsPPDK基因的表达受N浓度影响.。4、成功构建了 OsPPDK基因的pU1300-OsPPDK超表达载体和ds1301-OsPPDK RNAi载体,并对金23B和R287愈伤通过农杆菌介导法进行遗传转化,成功获得转化株。其中金23B OsPPDK超表达植株有7株,其中阳性植株有6株;金23B OsPPDK-RNAi植株3株,其中阳性植株有1株;R287 OsPPDK-RNAi植株2株,均为阳性植株,没有得到R287 OsPPDK超表达植株。对转化株进行表达量分析,结果显示:在6株超表达阳性转化株中,OsPPDK表达量普遍增加,其中最低增加2.4倍,最高增加6.43倍;而在3株RNAi阳性转化株中,金23B RNAi阳性转化株表达量下调了 48%,而2株R287 RNAi阳性转化株表达量分别下调了 43%和57%,说明构建的载体成功转入转化株中并能对OsPPDK表达产生影响。
【学位授予单位】：湖北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511
【图文】：

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【参考文献】