Sp1上调ETS2基因的表达及其分子机制研究

发布时间：2020-06-28 06:03

【摘要】：目的:位于人类21号染色体上的ETS2基因,在唐氏综合征(DS)中为三体型。多种DS动物及细胞模型提示ETS2基因高表达会导致DS相关的骨骼发育异常,神经细胞凋亡,转录激活APP基因,及白血病高发,而对实体肿瘤的发生却有抑制作用。ETS2基因虽然在DS病人中为三体型,但是其表达量远高于1.5倍。本研究以人类ETS2基因为研究对象,主要研究核转录因子Sp1对ETS2基因的转录调控及其分子机制。材料和方法:引物设计,荧光素酶报告基因质粒构建,细胞培养与转染,荧光素酶活性检测及数据分析,核蛋白提取,凝胶电泳迁移率分析,实时荧光定量PCR,蛋白质免疫印迹。结果:1.以ETS2基因第一个转录本的第一个外显子的第一个碱基为+1,成功克隆ETS2基因启动子区-1058至+132共1191bp DNA序列,将其插入载体pGL4.10构建重组荧光素酶报告基因质粒pETS2-A,通过分别固定5’端和3’端进行删切得到不同长度质粒。荧光素酶活性检测结果显示-748/+132至-748/+48有正性调控区域。2.转录因子预测软件分析发现,+48至+132启动子区域发现有多个Sp1结合位点。3.将软件评分最高的Sp1位点突变,突变型质粒(pETS2-A Mut)转染HEK293和SH-SY5Y细胞,荧光素酶活性下降40%(p0.05)。4.电泳迁移率分析提示ETS2基因启动子+40至+70bp为一个具有功能活性的Sp1位点。5.质粒pETS2-A与pCGN-Sp1共转染,结果显示荧光素酶活性分别在HEK293细胞系和SH-SY5Y细胞系中升高了2.37倍(p0.05)和2.5倍(p0.05)。6.在HEK293细胞系和SH-SY5Y细胞系中过表达Sp1,ETS2基因mRNA表达水平分别是对照组的1.43倍(p0.05)和1.39倍(p0.05)。7.在HEK293细胞系和SH-SY5Y细胞系中过表达Sp1,ETS2蛋白水平分别是对照组的2.74倍(p0.0001)和1.96倍(p0.001)。将HeLa细胞系中的Sp1敲低后,ETS2蛋白水平表达减少。结论:ETS2基因在-1058/+132区域有显著启动子活性,且该区域存在Sp1功能结合位点。Sp1能明显上调ETS2 mRNA和蛋白水平。目的:研究肌肽(Carnosine,CAR)对四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)诱导的化学性肝损伤小鼠氧化应激和炎症反应的影响。材料和方法:30只ICR小鼠被随机均分为对照组、CCl4模型组和CAR组。除对照组外,模型组和CAR组均以10 m L/kg剂量的0.2%CCl4花生油溶液灌胃,建立肝损伤模型。造模后CAR组连续7天给予300 mg/kg肌肽干预。第8天采血测定各组血清中谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、白蛋白(Albumin,ALB)和谷氨酰转肽酶(Glutamyltranspeptidase,GGT)水平,同时HE染色观察肝组织病理变化,ELISA检测超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性和谷胱甘肽(Glutathion,GSH)及丙二醛(Malonaldehyde,MDA)的含量变化,Western blot检测环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)和血红素氧合酶1(Heineoxygenase-1,HO-1)的表达;RT-PCR检测炎症因子白介素1β(Interleukin1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)和白介素10(Interleukin 10,IL-10)的水平。结果:与模型组相比,经肌肽干预后,CAR组小鼠血清中ALT、AST和GGT水平下调明显(t=5.776,P=0.000;t=7.443,P=0.000;t=4.548,P=0.000),ALB水平回升(t=6.061,P=0.000),肝功指标明显恢复;氧化应激标记物SOD活性(t=6.818,P=0.000)和GSH含量(t=5.739,P=0.000)增加,MDA含量得以明显下降(t=6.526,P=0.000);氧化/氧合蛋白酶COX-2表达降低(t=5.754,P=0.001),但HO-1表达仍持续上升(t=2.367,P=0.001);炎症因子TNF-α(t=7.025,P=0.000)和IL-1β(t=11.963,P=0.000)的m RNA水平获得明显下调,IL-10则有明显增加(t=6.074,P=0.000)。结论:肌肽可通过缓解机体氧化应激状态和影响炎症反应水平来改善和保护CCl4诱导的化学性肝损伤。结论:肌肽可通过缓解机体氧化应激状态和影响炎症反应水平来改善和保护CCl4诱导的化学性肝损伤。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R725.9
【图文】：

基因启动子,重组质粒,检测结果,质粒

重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 ETS2 基因启动子区不同长度质粒的酶切鉴定图谱及其对应的位置示意e 1 The different length promoter of ETS2 gene were coloned into pGL4.10mbers represent the end points of each construct.Arrow shows the directiotranscription.All plasimids were confirmed by enzyme digestion.建的质粒和内参质粒 pCMV-Rluc 共转染至 HEK293 细胞，检测区不同位置的荧光素酶活性，寻找其功能区域。结果显示：固定切到-1001 时，活性明显增加（p<0.05），提示可能存在下调元件390 时，活性却明显下降，说明该区域存在上调元件。固定 5’端，间存在正性调控区域。荧光素酶检测结果如下图所示：

基因启动子,检测结果,质粒,转录因子

3 ETS2 基因启动子区转录因子预测。+1 为第一个外显子的第一个碱基。下划线的为预到的转录因子。igure 3 The sequence of the human ETS2 gene promoter from-1058 to +132.The underlinucleotides represent putative transcription factors.转录因子预测结果显示，Sp1 可能参与调控 ETS2 启动子活性，为进一步证作用，将 ETS2 启动子+48/+104 区域下划线的 Sp1 位点突变掉，构建 pETS变型双荧光酶报告基因质粒（pETS2-A-Mut）。将野生型 pETS2-A 及其突变TS2-A-Mut 转染 HEK293 和 SH-SY5Y 细胞，检测荧光素酶活性。HEK293 细，突变型启动子活性下降了 40%（图 4A），SH-SY5Y 细胞中，突变型活性也下降（图 4B）。结果说明 Sp1 可以调控 ETS2 基因启动子活性，突变位点及具果如下图所示：

【参考文献】