spink8基因对食管癌EC9706细胞增殖及迁移的抑制作用

发布时间：2020-07-03 07:19

【摘要】：研究背景和目的食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤,全世界每年约有20万人死于食管癌,对人类的生命和健康造成极大威胁。食管癌的病因尚未完全明了,通过多途径探索,发现其发病与遗传因素、亚硝胺慢性刺激、炎症及创伤、粮食和蔬菜中的微量元素含量等相关,但其确切致病机制有待深入研究。EC9706细胞是来源于食管癌组织的细胞株,在体外以EC9706细胞为研究对象,对于探讨和认识食管癌的生物学行为有重要的价值。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族(serine protease inhibitor kazal type,SPINK),成员包括SPINK1~12等多个亚族,该家族成员多与疾病和肿瘤相关,如spink1与胰腺癌相关,spink2与男性不育相关,spink7为食管癌相关基因等。spink7已被证实为肿瘤抑制基因,具有调控细胞增殖、诱导凋亡及抑制肿瘤迁移和侵袭等功能。以往的研究发现,食管组织内有SPINK8蛋白的内源性表达,同时另一项全基因组比对结果显示,spink8基因相对表达量在成人食管癌组织比正常食管及癌旁组织明显减少。但有关SPINK8蛋白的功能研究国内外文献报道甚少。spink8与spink7具有同源性,且模拟三维结构相似,但两种蛋白的氨基酸序列有部分差异,推测这两种蛋白特异性抑制的蛋白酶可能有所不同。本研究将根据NCBI数据库记录的spink8 c DNA序列构建能够表达sh RNA的重组质粒,并应用脂质体介导,将干扰重组质粒和过表达质粒分别转染EC9706细胞,观察EC9706细胞中spink8基因的表达情况,并讨论沉默spink8内源性基因及过表达SPINK8蛋白对EC9706细胞增殖、迁移和克隆形成能力的影响。实验将探索spink8是否属于抑癌基因,并初步阐述其作用方式,为食管癌的发生发展提供可能得新的理论机制,以求为治疗提供新的作用靶点。材料和方法1.以spink8的m RNA已知序列为靶点,构建p Genesil-SPINK8重组质粒及阴性对照质粒。2.重组干扰质粒p Genesil-SPINK8、阴性对照质粒、重组过表达载体p EGFP-C1-SPINK8和空质粒p EGFP-C1分别转染EC9706细胞株,细胞分为5组,即未处理组、干扰组、阴性对照组、空载体组和过表达组,分别用半定量RT-PCR和Western Blotting检测对蛋白表达水平进行鉴定。3.绘制MTT生长曲线检测转染后各实验组细胞的增殖能力。4.克隆形成实验检测转染后各实验组的细胞克隆形成能力。5.划痕愈合实验检测转染后各实验组细胞的体外迁移能力。6.统计学分析:所有数据均由SPSS17.0软件处理,定量资料应用均数±标准差(Mean±SD)表示;多组均数差异的比较采用单因素方差分析(ANOVA),并用LSD-t法进行组间比较;以α=0.05为显著性检验水准。结果1.成功构建p Genesil-SPINK8重组质粒,并且应用限制性内切酶SalⅠ进行消化,证实重组质粒能被切出长约400 bp的小带;测序结果与设计的完全相符。2.p Genesil-SPINK8重组质粒转染EC9706细胞后,RT-PCR检测和Western Blotting结果显示,spink8在m RNA和蛋白的表达水平均受到明显抑制(P0.05)。3.p EGFP-C1-SPINK8重组质粒转染EC9706细胞后,RT-PCR检测和Western Blotting结果显示,spink 8在m RNA和蛋白的表达水平均明显提高(P0.05)。4.MTT生长曲线结果显示,过表达SIPNK8蛋白能够抑制EC9706细胞增殖,而干扰其表达后细胞的增殖能力增强。5.克隆形成实验结果显示,过表达SPINK8蛋白的EC9706细胞体外克隆形成能力下降,而干扰其表达后克隆形成能力提高。6.划痕实验结果显示,过表达SPINK8蛋白的EC9706细胞体外迁移能力降低,而干扰其表达量后的细胞迁移速率加快。结论1.成功构建p Genesil-SPINK8重组质粒。2.合成的si RNA能够有效抑制EC9706细胞SPINK8蛋白的内源性表达。3.spink8基因对EC9706细胞的增殖及克隆形成能力具有一定的抑制作用。4.spink8基因对EC9706细胞体外迁移能力具有一定的抑制作用。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 高冬玲;张红新;陈奎生;张岚;宋一民;张云汉;;小分子干扰RNA对EC9706细胞中血管内皮生长因子C表达的影响[J];郑州大学学报(医学版);2007年06期

2 王晓兰;王淑英;王建刚;;壁虎醇提物对人食管鳞癌细胞EC9706的作用和体内抗肿瘤活性[J];中国中药杂志;2010年16期

3 张红波;屈二军;杨海波;宋巍;陈兰英;;韭籽多糖对食管癌EC9706细胞增殖和凋亡的影响[J];癌变.畸变.突变;2013年06期

4 赵秋民,陈奎生,温洪涛,王忠民,高冬玲,张云汉,张岚,宋一民;应用完整原位杂交技术检测人食管癌EC9706细胞中胰岛素样生长因子1受体mRNA的表达[J];中国临床康复;2005年22期

5 郝炳章;冯常炜;卢丹;;姜黄素对人食管癌EC9706细胞增殖及侵袭的影响[J];中国现代医药杂志;2011年01期

6 陈兰英;宋巍;杨海波;于淮滨;刘亚军;支双成;杨峰;;大蒜素对人食管癌EC9706细胞凋亡的诱导作用[J];癌变·畸变·突变;2013年03期

7 韩亚玲;冯彦斌;罗曼莉;徐昕;蔡岩;王明荣;;人食管癌EC9706单克隆的分离培养及其生物学特性的研究[J];遗传;2007年11期

8 金伟;董涛;栾春艳;赵存新;张银华;;辛伐他汀对食管癌EC9706细胞增殖及核因子κB的影响[J];中国肿瘤临床;2010年14期

9 焦峰;黄海进;;紫檀芪对人食管癌EC9706细胞生长的影响及其机制[J];西南国防医药;2012年08期

10 王涛;董子明;赵国强;;调控食管癌EC9706细胞DNA聚合酶β表达的初步研究[J];中国病理生理杂志;2010年08期

相关会议论文 前7条

1 陈兰英;杨海波;孙婕;谢朝晖;张红波;;人食管癌EC9706细胞凋亡前后核基质蛋白的提取与分析[A];低碳生活与健康损害论坛——中国环境诱变剂学会风险评价专业委员会全国第十三届学术会议暨第四届第5次委员会会议论文集[C];2011年

2 陈兰英;宋巍;杨海波;于淮滨;刘亚军;支双成;杨峰;;大蒜素对食管癌EC9706细胞增殖和凋亡的影响[A];第十四届中国科协年会第17分会场：环境危害与健康防护研讨会论文集[C];2012年

3 王少康;孙桂菊;杨磊;李莉华;;维生素D_3对食管癌EC9706细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响[A];营养与慢性病——中国营养学会第七届理事会青年工作委员会第一次学术交流会议论文集[C];2010年

4 王俊玲;郑乃刚;吴景兰;杨胜利;;纳米脂质体槲皮素联合丁酸钠对人食管癌EC9706细胞增殖的作用[A];低碳生活与健康损害论坛——中国环境诱变剂学会风险评价专业委员会全国第十三届学术会议暨第四届第5次委员会会议论文集[C];2011年

5 吴丛梅;黄天华;谢庆东;吴德生;徐小虎;;pEgr-P16重组质粒的构建及其在人食管癌EC9706细胞中的辐射诱导表达[A];中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年

6 张红新;尹玉慧;陈奎生;高冬玲;宋一民;张云汉;;siRNA抑制食管癌EC9706细胞VEGF-C体外表达的定量研究[A];第十二届中国体视学与图像分析学术会议论文集[C];2008年

7 章旭耀;石晓静;马永成;陈冬;王冉;刘宏民;;抗肿瘤新药JD27通过线粒体途径诱导食管癌EC9706细胞凋亡[A];2013医学前沿论坛暨第十三届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2013年

相关硕士学位论文 前10条

1 李扬;白藜芦醇对人食管癌EC9706细胞周期和凋亡的影响及其作用机制[D];河北医科大学;2014年

2 孙艳;spink8基因对食管癌EC9706细胞增殖及迁移的抑制作用[D];郑州大学;2016年

3 刘用金;特异核基质蛋白在人食管癌EC9706细胞凋亡中作用的初步研究[D];厦门大学;2009年

4 宋建晔;姜黄素诱导食管癌EC9706细胞凋亡过程中核基质蛋白的表达变化[D];厦门大学;2009年

5 郝炳章;姜黄素对人食管癌EC9706细胞增殖、侵袭的影响[D];郑州大学;2011年

6 刘晓东;GDC-0941诱导人食管癌EC9706细胞凋亡及相关机制的研究[D];郑州大学;2013年

7 曹静;HIF-1α表达与食管癌细胞株EC9706凋亡和增殖关系的研究[D];郑州大学;2006年

8 魏文启;沉默食管癌EC9706细胞CD147表达的初步研究[D];郑州大学;2009年

9 杨娟;TSC2反义寡核苷酸对人食管癌EC9706细胞增殖、凋亡的影响[D];郑州大学;2011年

10 胡婵丽;叶黄素对食管癌EC9706细胞增殖抑制和诱导分化效应及机制研究[D];郑州大学;2007年

本文编号：2739367