DRP1基因沉默对人胃癌细胞生物学行为的影响和机制的初步研究

发布时间：2020-07-05 03:56

【摘要】：目的:(1)构建靶向动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)基因的RNA干扰慢病毒表达载体,筛选稳定表达shRNA-DRP1的胃癌细胞株。(2)探讨DRP1基因沉默对胃癌细胞株BGC-823和MKN-45增殖、迁移、侵袭、凋亡及细胞周期的影响和机制。(3)检测DRP1在胃腺癌组织中的表达,探讨其与临床病理特征和预后的关系。方法:(1)采用qPCR技术检测正常人胃粘膜上皮细胞株GES-1、人胃癌细胞株MKN-28、SGC-7901、AGS、BGC-823及MKN-45中DRP1mRNA的表达水平,筛选出DRP1mRNA表达水平较高的细胞株用于基因干扰实验。设计3对shRNA序列(KD1、KD2、KD3)并合成2条互补的、编码shRNA的DNA单链,DNA单链退火形成双链DNA(dsDNA),dsDNA与经酶切的慢病毒载体连接。重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5a,采用PCR法筛选阳性克隆并测序鉴定插入序列是否正确;将得到的重组质粒在包装辅助质粒的辅助下共转染293T细胞,倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP的表达,评估转染效率。以稀释计数法测定病毒滴度。重组慢病毒载体感染MKN-45细胞并在荧光显微镜观察评估转染效率,采用qPCR技术检测DRP1mRNA的表达,筛选出基因干扰效率最高的一对shRNA序列用于后续实验。(2)以干扰效率最高的shRNA-DRP1慢病毒表达载体转染BGC-823和MKN-45细胞株,同时设置NC组(细胞感染空病毒)和CON组(未感染的细胞),分别采用MTT实验、克隆形成实验、划痕愈合实验、Transwell侵袭实验及流式细胞术检测细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及细胞周期。为探讨DRP1促进胃癌增殖的机制,采用western blot检测细胞DRP1、Cleaved caspase-3、p-CDK1(Tyr15)、Cyclin B1及自噬标记物LC3的表达。为进一步探讨DRP1在体内对胃癌生长的影响,将携带shRNA-DRP1慢病毒载体的MKN-45细胞株接种于裸鼠皮下建立胃癌裸鼠皮下移植瘤模型,接种后第8 d、11 d、14 d、18 d、21 d测量种植瘤的体积,绘制生长曲线,21 d后处死裸鼠,获取肿瘤,称重。(3)采用免疫组化(IHC)技术检测291例石蜡包埋的胃腺癌组织标本、145例近癌旁组织和远癌旁组织标本中DRP1的表达情况,应用Kaplan-Meier法和多因素COX回归风险模型分析DRP1表达与临床病理特征和预后的关系。采用qPCR技术检测10例新鲜胃腺癌近癌旁组织和远癌旁组织标本中DRP1mRNA的表达水平。结果:(1)DRP1mRNA表达水平在MKN-45、BGC-823、AGS、SGC-7901、MKN-28、GES-1细胞中逐渐降低(P0.001);经PCR筛选阳性克隆和测序结果显示与GenBank中的人DRP1 cDNA序列一致,表示质粒重组成功。重组质粒转染293T细胞后,倒置荧光显微镜下观察发现大量绿色荧光,72 h达到高峰,提示慢病毒包装成功。稀释计数法检测慢病毒滴度发现,LV-shRNA-DRP1(KD1),LV-shRNA-DRP1(KD2)及LV-shRNA-DRP1(KD3)组的病毒滴度分别为1×10~9 TU/mL、4×10~9 TU/m L及8×10~8TU/m L。shRNA-DRP1慢病毒载体成功转染MKN-45细胞,转染效率达80%以上。qPCR检测提示KD组的DRP1mRNA表达水平明显降低,提示shRNA-DRP1对目的细胞的DRP1基因沉默有效,且LV-shRNA-DRP1KD3)组的敲减效率最佳(P0.01)。(2)MTT实验结果显示,转染后连续培养4 d和5 d,KD组的OD490和OD490/fold均显著低于NC和CON组(P0.001);克隆形成实验结果示,KD组细胞克隆形成数较NC组显著降低(P0.001),表明DRP1基因沉默能降低细胞的增殖能力。划痕愈合实验结果显示,与NC组比较,KD组的划痕愈合率显著缩小(P0.01);Transwell侵袭实验结果显示,KD组的穿膜细胞数较NC组显著降低(P0.01),提示DRP1基因沉默可抑制细胞迁移和侵袭的功能。流式细胞术检测结果显示,与NC组比较,KD组细胞凋亡率较显著升高(P0.01),细胞周期分布呈现G2/M阻滞(P0.001),G1和S期细胞比例显著减少(P0.001),提示DRP1基因沉默可引起细胞凋亡和G2/M期阻滞。Western blot检测后发现DRP1基因沉默后,DRP1和Cyclin B1表达下调(均P0.001),Cleavedcaspase-3和p-CDK1(Tyr15)表达上调(均P0.001),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低(P0.01),提示自噬受抑制。裸鼠皮下移植瘤实验结果显示,与NC组比较,KD组移植瘤体积明显缩小,重量明显减轻(均P0.001)。(3)免疫组化发现DRP1在胞浆呈棕黄色染色,DRP1在胃远癌旁、近癌旁及腺癌组织中的表达阳性率逐渐升高(P0.001和P0.05);DRP1的表达阳性率随着淋巴结转移(P0.05)和TNM分期进展而升高(P0.05);Kaplan Meier生存分析发现,DRP1阳性表达的患者的总体生存期(OS)较阴性表达者短(P0.01);多因素COX风险模型进行多因素分析发现:年龄(P0.05)、分化程度(P0.05)、淋巴结转移(P0.01)及DRP1阳性表达(P0.05)是影响胃腺癌预后的独立危险因素。qPCR发现,DRP1mRNA在胃远癌旁、近癌旁及腺癌组织中的表达水平逐渐升高(P0.001)。结论:(1)DRP1基因沉默通过G2/M期阻滞、激活caspase-3及抑制线粒体自噬等途径抑制BGC-823和MKN-45细胞增殖、迁移、侵袭及诱导凋亡等生物学功能。DRP1可能成为胃腺癌的潜在分子治疗靶点。(2)DRP1在胃腺癌组织中过表达,DRP1的表达阳性率随着淋巴结转移和TNM分期进展而升高;DRP1阳性表达不但与患者总体生存率呈负相关,而且是胃腺癌患者预后独立风险因素之一。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2
【图文】：

细胞增殖,细胞,慢病毒感染,孔板

A. BGC-823 细胞；B. MKN-45 细胞注：与 NC 和 CON 比较，***P<0.001图 13. shRNA-DRP1 对 BGC-823 和 MKN-45 细胞增殖的影响（mean±SD）3 克隆形成实验检测细胞增殖shRNA 慢病毒感染 BGC-823 和 MKN-45 细胞，感染 3 d 后接种于 6 孔板，持续

划痕,软件测量,细胞迁移,实验检测

A. BGC-823 细胞；B. MKN-45 细胞注：***P<0.001图 14. shRNA-DRP1 对 BGC-823 和 MKN-45 细胞增殖的影响（mean±SD）4 划痕愈合实验检测细胞迁移采用 image J 软件测量各组的划痕面积，计算划痕愈合率=（0 h 的划痕面积-48 h

【参考文献】