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西方蜜蜂上颚腺分泌物合成关键基因筛选及其受日龄和营养因素的调控研究

发布时间:2020-07-11 09:00
【摘要】:上颚腺是蜜蜂重要的外分泌腺体,其分泌物是维系蜂群社会性结构的重要物质。蜂王和工蜂上颚腺分泌物合成均以硬脂酸为合成前体,但在合成过程中表现出级型差异性,导致分泌物的组分产生差异。蜂王上颚腺分泌物以9-羰基-2癸烯酸(9-ODA)为主,有吸引工蜂和雄蜂、抑制工蜂卵巢发育等作用;工蜂上颚腺分泌物以10-羟基-2癸烯酸(10-HDA)和10-羟基癸酸(10-HDAA)为主,是蜂王浆的重要组成部分。研究蜜蜂上颚腺中基因的表达与调控,对揭示上颚腺分泌物合成的分子机制和深入了解上颚腺分泌物级型差异形成的分子机制有着重要的意义。本研究采用高通量测序技术,比较了意大利蜜蜂(Apismellifera ligustica)成熟蜂王上颚腺、正常蜂群工蜂上颚腺和无王蜂群产卵工蜂上颚腺的基因表达谱,以寻找蜜蜂上颚腺分泌物合成相关的关键基因;在此基础上我们利用RNA干扰技术敲降基因表达,进一步验证了特定基因在工蜂上颚腺分泌物合成过程中的作用。工蜂上颚腺分泌的10-HDA是蜂王浆中重要的脂肪酸成分,是蜂王浆质量控制的主要技术指标,同时也是蜂王浆定价的决定性因素之一,因此研究工蜂上颚腺的分泌规律与调控,在养蜂生产上有着重要的作用。本研究分析了工蜂上颚腺分泌物合成相关基因在不同日龄工蜂上颚腺中的表达模式,同时比较了不同营养条件下笼养工蜂上颚腺的基因表达谱,以期从分子水平上说明日龄和营养条件对工蜂上颚腺分泌能力的影响。主要研究结果如下:(1)蜜蜂上楴腺分泌物生物合成分子机制研究上楴腺是蜜蜂重要的外分泌腺,其分泌物在组成和功能上有着明显的级型差异。本研究首次利用高通量测序技术对意大利蜜蜂成熟蜂王、有王群正常工蜂和无王群中卵巢发育工蜂的上颚腺基因表达谱进行了检测,以获取蜜蜂上颚腺分泌物合成相关的候选基因。在这3个样本之间共检测到5457个差异表达基因,其中2629个基因在蜂王和正常工蜂间差异表达,在两种工蜂样本间则有2761个差异表达基因,而在失王工蜂和蜂王样本间检测到4662个差异表达基因。在这些差异表达基因中我们发现了多个可能与上颚腺中脂肪酸类分泌物合成相关的基因,涉及脂肪酸的羟基化、降解代谢与末端羟基修饰等多个过程,初步揭示了西方蜜蜂上颚腺的基因表达谱和上颚腺分泌物生物合成的相关分子基础。(2)蜜蜂上额腺分泌物合成相关细胞色素P450基因的筛选在上颚腺脂肪酸分泌合成的过程中,细胞色素P450氧化酶系催化的硬脂酸末端羟基化是整个反应的起始步骤。为了探明参与这一合成过程的细胞色素P450,本实验在上一章节研究的基础上,检测比较了 6个细胞色素P450在蜜蜂不同级型、不同生活阶段和不同组织间的表达模式。结果显示CYP6AS8和CYP6AS11分别在工蜂和成熟蜂王的上颚腺中高丰度表达,并且在级型间有着显著的差异,证明这两个基因与上颚腺的功能有着密切的关系。进一步,我们使用RNA干扰技术敲降了C PYAS8基因在工蜂上楴腺中的表达,以明确CYP6AS8在工蜂上颚腺中的功能。实验结果显示,敲降CYP6AS8基因的表达后,工蜂上颚腺中10-HDA的合成水平也随之显著降低,证明CYP6AS8与工蜂上颚腺分泌物合成有着密切的联系。(3)不同日龄工蜂上颚腺中10-HDA合成相关基因表达模式研究工蜂上颚腺是蜂王浆中重要功能活性物质10-HDA的主要分泌器官,研究工蜂上颚腺分泌能力的变化规律在养蜂生产上有着重要的意义和价值。我们使用荧光定量PCR技术检测比较了与10-HDA合成相关关键基因:CYP6AS8、CPTI、ACOX1和ACOX3,以及在上颚腺中高丰度表达基因:CSP3和mrjp1在不同日龄工蜂上颚腺中的表达规律。结果显示,随着工蜂日龄的增长,除mrjp1外,CYP6AS8、CPTI、ACOX1、ACOX3和CSP3在工蜂上颚腺中的表达基本保持稳定,显示工蜂上颚腺的分泌物合成分泌能力不会随工蜂日龄的变化发生明显的改变。(4)不同营养条件对工蜂上颚腺合成能力及其相关基因表达研究蜜蜂的营养水平对蜜蜂腺体的发育和分泌能力有着显著的影响。通过人为控制工蜂日粮营养条件,我们探索了工蜂日粮营养水平对上颚腺分泌能力的影响。使用气相色谱测定了不同营养条件下工蜂上颚腺中10-HDA的分泌情况,同时利用高通量测序技术测定正常饲养工蜂和限制营养工蜂上颚腺的转录组,比较了不同营养条件下工蜂上颚腺基因的表达情况。在缺乏营养的条件下,工蜂上颚腺的10-HDA合成有着显著地下降;而转录组数据显示,与10-HDA合成相关的基因却表现出了上调的趋势。综上所述,本论文系统研究了上颚腺分泌物合成的分子机制,确定了参与工蜂上颚腺分泌物合成的细胞色素P450,有助于进一步深入研究上颚腺功能级型差异的分子基础;通过研究日龄和营养条件对工蜂上颚腺基因表达的影响,为研究西方蜜蜂工蜂上颚腺分泌能力的调控提供了线索。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S891
【图文】:

上颚腺,蜂王,分泌物,主要成分


decenoic邋acid,邋(R,S)-9-HDA邋)、对经基苯甲酸甲醋(methyl-p-hydroxybenzoate,逡逑HOB)、4-经基-3-甲氧基苯乙醇(4-hydroxy-3-methoxyphenylethanol,HVA)等逡逑(Slessoretal.邋1988;邋Slessoretal.邋1990)(图1-2),这些物质统称为蜂王上额腺信息逡逑素(queen邋mandibular邋pheromone,邋QMP),其在蜂群发展和群内调控中发挥极其重逡逑要的作用。此外,蜂王上楴腺还会分泌少量co位功能化脂肪酸(Plettneretal.邋1997)。逡逑9逦O逦OH逦O逡逑,丨逦,人、、/八?义、0H逡逑9-饿猫-2癸烯酸9-ODA逦9-羟基-2癸烯酸(/?,S)-9-HDA逡逑0、逦9^oh逡逑0'^/邋CH3逦N逡逑OH逦OH逡逑对K基苯1i1酸中酯HOB逦4-径基-3-甲氧葙苯乙?邋HVA逡逑图1-2蜂王上颚腺分泌物主要成分逡逑Figure邋1-2邋Major邋components邋in邋the邋mandibular邋gland邋secretion邋of邋honey邋bee邋queen逡逑3逡逑

上颚腺,工蜂,分泌物,主要成分


工蜂上楴腺分泌物的主要成分为10-轻基-2癸Zf酸(10-hydroxy-2(E)-decenoic逡逑acid,邋10-HDA)、10-经基癸酸(10-hydroxy-decanoicacid,10-HDAA)和邋8-轻基辛逡逑酸(8-hydroxyoctanoicacid,8-HOAA)等co位功能化脂肪酸(图1-3)。针对工蜂逡逑上颚腺分泌规律的研究发现,上颚腺中I0-HDA的含量随日龄增长逐渐递增逡逑(Yangetal.2017;黄少康etal.2010),这与上颚腺的发育变化相一致(Valletetal.逡逑1991)。逡逑工蜂上楩腺是蜂王浆中脂肪酸成分的最主要来源(Isidorov邋et邋al.邋2009),对蜂逡逑王浆的品质有着极大影响。蜂王浆是工蜂上楴腺、咽下腺和唾液腺共同分泌的一逡逑种蜜蜂产品,在蜂群中主要被用于饲喂蜂王、蜂王幼虫和3日龄以内工蜂幼虫,逡逑其脂肪酸成分在蜂群营养(Crailsheim邋1992)和幼虫发育(Kinoshitaand邋Shuel邋1975)逡逑等方面有重要作用。同时,蜂王浆作为一种高价值的保健食品,其中的脂肪酸还逡逑具有抗菌(Blumetal.邋1959)、免疫调节、抗癌症(Lietal.2013)、调节细胞生长和逡逑分化(1^1101^13丨_2007;1^0>^-]\4丨3^^6131.2004)等功能。此外,工蜂还将10-1?八逡逑掺入到蜂粮中(Isidorov邋et邋al.邋2011),以抑制花粉萌发(Iwanami邋et邋al.邋1979)和细菌增逡逑殖(Eshraghi邋and邋Seifollahi邋2003)。逡逑随着年龄和劳动分工的变化

蜜蜂,上颚腺,羟基化,蜂王


从化学合成的角度阐述了上颚腺脂肪酸分泌物的合成过程。研究结果显示,逡逑在蜂王和工蜂上颚腺中,脂肪酸分泌物的合成均经过羟基化、(3氧化和功能基团逡逑修饰3个步骤(图1-4)。逡逑在测试多种脂肪酸后,Plettner等(1995)确定硬脂酸是上颚腺合成分泌物的最逡逑适合成前体。通过进一步研究发现,硬脂酸的来源主要有两种,一是外源性摄入逡逑后,直接进入上颚腺参与合成;二是以乙酸等短链脂肪酸为原料,在上颚腺中从逡逑头合成(Plettner邋etal.邋1998)。逡逑硬脂酸首先发生CO位或C0-1位羟基化,这一反应是由细胞色素P450氧化酶逡逑催化的单加氧反应,不涉及双键的生成或水解(Plettner邋etal.邋1998)。工蜂和蜂王逡逑的上颚腺均不具备将co位羟基化和0)-1位羟基化脂肪酸相互转化的能力。通过逡逑比较上颚腺中?位羟基化和(《-1位羟基化产物的积累量发现,工蜂与蜂王上颚逡逑腺中二者的生成速率无显著差异(Plettner邋etal.邋1996),表明经基化的位点并不具逡逑备级型特异性。羟基脂肪酸随后进入不完全的P-氧化过程

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本文编号:2750204

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