Sohlh1基因敲除小鼠精母细胞减数分裂异常及其机制研究

发布时间：2020-07-12 09:07

【摘要】：目的:睾丸作为雄性哺乳动物的生殖器官,具有产生成熟精子、分泌雄性激素的功能,从出生至成年要经历复杂而漫长的发育过程。雄性的精子发生起源于精原干细胞(spermatogenial stem cells,SSCs),这类细胞拥有三种不同的命运:(1)维持干细胞特性的精原干细胞,是雄性生殖能力的保障;(2)通过凋亡清除发育异常的生精细胞,以保证生精细胞质量;(3)经有丝分裂发育为精原祖细胞(spermatogonial progenitors——A_s,A_(pr),A_(al):A_(al4),A_(al8),A_(al16)),精原祖细胞在经历A型(A_1,A_2,A_3,A_4)、中间型以及B型精原细胞的有丝分裂发育并完成染色质复制后便可进入配子发生的程序——减数分裂。减数分裂期联会复合体的形成为同源染色体之间进行同源重组、遗传信息交换提供结构支撑,同源染色体间若无联会复合体减数分裂停滞。减数分裂之后是精子形成期,精子细胞在这一时期经历一系列的结构重塑和形态变化之后形成成熟精子。精子发生复杂而漫长的发育过程受一系列按时空顺序表达的特定基因影响,任何发育过程停滞都会导致雄性不育,因此,生殖细胞特异表达转录因子调控一系列特定基因程序性表达在精子发生中发挥至关重要的作用。精卵发生特异表达螺旋-环-螺旋转录因子1(spermatogenesis-and oogenesis-specific helix-loop-helix transcription factor 1,Sohlh1)是生殖细胞特异表达转录因子,属于bHLH转录因子家族,该基因位于小鼠的第2号染色体及人的第9号染色体上。SOHLH1在雄性小鼠体内主要表达于A_(al)~B型精原细胞,在精子发生中通过转录调控下游基因表达发挥重要作用。通过对不同地区、不同民族的男性非梗阻性无精子症(Nonobstructive azoospermia,NOA)患者基因突变筛查,发现SOHLH1基因不同位点发生非同义突变。NOA为睾丸生精功能障碍,临床表现为男性不育,严重影响个人生活质量、人类遗传信息多样性。因此许多学者将SOHLH1基因视为导致男性不育的候选基因,探讨该基因在人类精子发生中的重要作用。研究发现,Sohlh1基因敲除(Sohlh1 knockout,KO)小鼠在有丝分裂期异常发育的精原细胞并未凋亡,部分精原细胞可提前进入减数分裂继续发育,在减数分裂阶段精母细胞发生大量凋亡,精子发生失败、小鼠不育。目前关于Sohlh1敲除小鼠精原细胞发育异常的分子机制尚不十分清楚,Sohlh1敲除小鼠精母细胞发育是否受到影响也有待于深入研究。本研究旨在通过一系列形态学和组织学观察方法,分析Sohlh1基因缺失对小鼠和精母细胞减数分裂发育的影响,通过芯片分析筛选Sohlh1敲除雄性小鼠差异表达基因;并通过Western Blot、免疫荧光和透射电镜等系列实验进一步分析SOHLH1在精母细胞发育过程中的作用,探讨该转录因子是否能直接转录调控联会复合体蛋白编码基因Sycp1和Sycp3,阐明SOHLH1对雄性小鼠精母细胞发育的影响及其机制,为充分了解由于SOHLH1突变导致男性患者不育的发病机制提供理论依据。研究方法:本研究以Sohlh1基因敲除雄鼠与野生型C57BL/6J雄鼠为研究对象,对比分析PD7.5(出生后7.5天)、PD10.5、PD14.5、PD23.5、PD49.5小鼠外观和睾丸发育、精子发生等指标的变化情况;利用芯片分析PD7.5小鼠睾丸差异表达基因;选取PD14.5小鼠睾丸为研究对象,检测小鼠睾丸中联会复合体蛋白表达变化,利用透射电镜观察精母细胞中联会复合体形成情况;选取PD14.5野生型雄鼠睾丸作为观察对象,对SOHLH1蛋白与SYCP3蛋白进行共定位分析;通过构建Sycp1和Sycp3启动子表达载体,利用双荧光素酶报告基因研究SOHLH1蛋白对Sycp1和Sycp3启动子序列的转录调控活性;利用ChIP实验寻找SOHLH1在Sycp1和Sycp3启动子序列上的结合位点。结果:1、形态观察结果表明,与野生型(WT)C57BL/6J相比,各阶段(PD7.5、PD10.5、PD14.5、PD23.5、PD49.5)Sohlh1敲除(KO)雄鼠外观并未出现异常,而睾丸自出生后第14.5天开始发育迟缓,并在此后(PD23.5、PD49.5)处于维持阶段。组织学观察结果表明,各阶段(PD7.5、PD10.5、PD14.5、PD23.5、PD49.5)WT小鼠生精细胞正常发育,Sohlh1 KO小鼠生精细胞自出生后10.5天开始出现差异,曲细精管内精母细胞数减少,出生后14.5天时未见粗线期、双线期精母细胞,出生后23.5天、49.5天未见粗线期、双线期精母细胞及以后各阶段生精细胞。Sohlh1基因影响睾丸发育主要是通过阻碍细线期、偶线期精母细胞向粗线期、双线期发育实现的。2、在Sohlh1基因敲除小鼠出生后7.5天睾丸中,有205个差异表达基因,47.6%(66个)基因表达上调,67.8%(139个)基因表达下调。下调基因包括减数分裂、信号通路及生殖发育相关因子。3、Real-time PCR结果显示Sohlh1基因缺失联会复合体蛋白因子Sycp1和Sycp3以及减数分裂相关因子Tex11表达显著下调,在出生后14.5天时,由于Sohlh1基因缺失,SYCP1蛋白和SYCP3蛋白表达显著下调,透射电镜观察精母细胞核中未见联会复合体结构,染色体联会异常,免疫荧光结果显示SOHLH1蛋白与SYCP3蛋白表达存在相关性,提示Sohlh1基因可能影响减数分裂过程中联会复合体形成从而影响精母细胞发育。4、利用双荧光素酶报告基因证实,当真核表达载体SOHLH1存在时,Sycp1和Sycp3荧光表达载体荧光值增强,提示转录因子SOHLH1对联会复合体蛋白基因Sycp1和Sycp3表达具有转录激活作用。当突变Sycp1-249bp~84bp区域单个E-box结构域(-45bp、-94bp)或两个E-box结构域都突变时,SOHLH1对Sycp1的转录激活作用消失;当Sycp3-286bp~66bp区域-43bp E-box结构域突变时,SOHLH1对Sycp3的转录激活作用并未消失,而Sycp3-286bp~66bp区域-64bp E-box结构域突变或-43bp、-64bp两个E-box结构域都突变时,SOHLH1对Sycp3的转录激活作用显著下降但并未彻底消失。结果显示SOHLH1可通过Sycp1和Sycp3基因转录起始位点上游E-box结构域对Sycp1和Sycp3基因起转录激活作用。5、在小鼠睾丸中,转录因子SOHLH1能够结合于Sycp1转录起始位点上游-1276bp、-708bp和-94bp E-box结构域,能够结合于Sycp3转录起始位点上游-64bp和-43bp E-box结构域。结论:1、Sohlh1基因缺失小鼠精母细胞发育阻滞在减数分裂期。2、减数分裂相关基因Sycp1和Sycp3是Sohlh1基因敲除小鼠精母细胞发育阻滞的重要候选基因。3、Sohlh1基因缺失小鼠精母细胞联会复合体异常,染色体无法形成联会。4、Sohlh1基因缺失小鼠联会复合体蛋白SYCP1和SYCP3表达显著下调,SOHLH1蛋白与SYCP3蛋白在出生后14.5天小鼠睾丸组织中共表达。4、双荧光素酶报告基因证实,转录因子SOHLH1对联会复合体蛋白基因Sycp1和Sycp3表达具有转录激活作用。5、在小鼠睾丸中,转录因子SOHLH1能够结合于Sycp1转录起始位点上游-1276bp、-708bp和-94bp E-box结构域,对Sycp1具有转录调控作用;能够结合于Sycp3转录起始位点上游-64bp和-43bp E-box结构域,通过-64bp E-box结构域对Sycp3具有转录调控作用。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78;Q23
【图文】：

技术路线图,鼠尾,离心管,轻弹

图 2.1 技术路线图2.3 实验方法2.3.1 Sohlh1 KO 与 WT 小鼠基因型鉴定取 7.5d 雄鼠鼠尾，约 0.5cm 长，置于 1.5mL 离心管中，加入 500μL 鼠尾消化液（NaCl 2.93g,SDS 2.5g,1M Tris-HCl pH8.0 5mL,0.5M EDTApH8.0 10mL 定容至 500mL）和 5μL 蛋白酶 K，55°C 水浴锅中消化过夜，加入 500μL 苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），上下颠倒 15 次混匀，12000g 离心 10min。小心取出离心管吸取 380μL 上清液至新 1.5mL 离心管中，加入等体积异丙醇后上下颠倒 15 次至出现白色絮状物沉淀，12000g 离心 10min。弃上清后加入 500μL75%酒精，轻弹管底将使白色沉淀悬浮，12000g离心10min。弃上清，室温晾干后加入40μLddH2O溶解 DNA 过夜，4°C 保存。分别用基因鉴定引物以提取鼠尾 DNA 为模板，PCR扩增目的片段，2%琼脂糖凝胶电泳检测目的片段拍照。

序列,产物,PCR鉴定,外显子

3 结果 KO 与 WT 小鼠基因型鉴定hlh1-KO 引物获得的 PCR 产物为基因敲除打靶载体中DNA 片段；使用 Sohlh1-WT 引物获得的 PCR 产物为DNA 片段。可根据两对引物扩增产物鉴定小鼠基因型除小鼠的基因组部分外显子被打靶载体序列所取物 PCR 扩增后电泳产物仅可见 Sohlh1-KO 引物 PCR一个等位基因含有 Sohlh1 全部外显子，另一等位基 PCR 后产物既有 Sohlh1-WT 引物扩增产物又有 Soh型小鼠基因组中无打靶载体序列插入，无外显子被敲物扩增产物。

外观,睾丸,小鼠

图 3.2 不同阶段小鼠外观及睾丸外观观察A、B 分别为 PD7.5 WT 和 KO 雄鼠外观，未见明显差异；C、D 分别为 PD10.5 WT 和KO 雄鼠外观，未见明显差异；I、J 分别为 PD14.5 WT 和 KO 雄鼠外观，未见明显差异；K、L 分别为 PD23.5 WT 和 KO 雄鼠外观，未见明显差异；Q、R 分别为 PD49.5 WT 和 KO 雄鼠外观，未见明显差异；E、F 分别为 PD7.5 WT 和 KO 雄鼠睾丸外观，未见明显差异；G、H分别为 PD10.5 WT 和 KO 雄鼠睾丸外观，未见明显差异；M、N 分别为 PD14.5 WT 和 KO雄鼠睾丸外观，未见明显差异；O、P 分别为 PD23.5 WT 和 KO 雄鼠睾丸外观，KO 睾丸明显小于 WT；S、T 分别为 PD49.5 WT 和 KO 雄鼠睾丸外观，KO 睾丸明显小于 WT。3.3 不同阶段小鼠睾丸组织切片 HE 观察成年小鼠睾丸曲细精管中存在各期生精细胞，其形态如图 3.3 所示。HE 染色 A 型精原细胞核体积较小，染色较浅，核膜内侧可见深染染色质（图 3.3A）；中间型和 B 型精原细胞与 A 型精原细胞相似，但核膜内侧深染染色质数目增多

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