大蒲莲猪和长白猪TLRs、NLRs和AMPs基因的组织差异表达分析

发布时间：2020-07-12 21:13

【摘要】：疾病尤其是病毒性传染病是现代养猪生产的一大天敌,药物、疫苗和抗生素等的频繁使用引发了耐药性频发、药物残留严重等问题的出现,导致我国养猪业产生巨大的经济损失。因此,提高猪自身的免疫力和抗病力,成为目前养猪业发展中急需解决的问题。过去的研究发现我国地方猪种大蒲莲猪的抗病性和免疫能力明显优于国外长白猪,大蒲莲猪的这种特性可以作为抗病育种的优质品种与种质资源,为寻找猪抗病育种候选基因提供优良的素材。而抗病力的高低与免疫系统的应答反应能力有关,模式识别受体(PRRs)在先天免疫系统中主要用来识别病原相关分子模式,在动物机体抵御病原微生物入侵过程中发挥重要作用。而抗菌肽作为一种小肽类分子,在动物机体中广泛分布,具有广谱的抗菌性和抗病毒性。本试验采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术和Western blot技术检测9种TLRs(TLR1~TLR9)、5种NLRs(NOD1、NOD2、CIITA、NLRC3和NLRX1)以及2种抗菌肽(pBD-1和PR-39))在不同月龄的两品种猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、扁桃体、下颌淋巴结、肠系膜淋巴结等组织中的表达,并进行差异表达分析,以期寻找大蒲莲猪和长白猪中免疫相关差异表达基因,进而为猪抗病育种提供理论依据,加速实现抗病育种的最终目标。本研究的结果如下:1.9种TLRs基因的差异表达分析:在两品种猪的8种组织中均有表达,其中TLR1和TLR2在下颌淋巴结表达最高,TLR3在肾脏最高,TLR5和TLR6在肝脏最高,TLR4、TLR7、TLR8和TLR9在脾脏最高;在两品种猪之间,在大蒲莲猪的表达显著高于长白猪(P0.05);在表达时序上,多数TLRs基因随着月龄的增加表达水平也不断升高。2.5种NLRs基因的差异表达分析:在两品种猪8种组织中均有表达,其中NOD1、NOD2和CⅡTA在脾脏表达最高,NLRC3在下颌淋巴结最高,NLRX1在肝脏最高;在两品种猪之间,所有组织中大蒲莲猪的表达显著高于长白猪(P0.05);在表达时序上,多数NLRs的表达在4月龄最高,然后随之下降。3.2种抗菌肽基因的差异表达分析:在所检测的组织中均有表达,其中pBD-1在扁桃体表达最高,PR-39在肠系膜淋巴结中最高;在两品种猪之间,其在大蒲莲猪中的表达显著高于长白猪(P0.05);在表达时序上,两个基因在各组织中均在4月龄的表达水平最高,随后开始下降。4.检测TLR4和NOD2在不同器官和组织中的蛋白表达水平:结果发现两个蛋白在各检测组织中均有表达,且与荧光定量的结果具有一致性。TLR4的表达趋势为:脾脏肺脏扁桃体心脏肾脏肝脏下颌淋巴结肠系膜淋巴结,而NOD2的表达趋势为:脾脏肺脏扁桃体肠系膜淋巴结下颌淋巴结肝脏肾脏心脏。综上所述,三类免疫相关基因在大蒲莲猪中表达显著高于长白猪(P0.05),这可能是大蒲莲猪抗病力和免疫力高于长白猪的重要原因。此外,这些免疫相关基因的表达受品种、年龄和组织的影响,可能会导致猪抗病力的遗传差异。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S828
【图文】：

内参,标准曲线,长白猪,肠系膜淋巴结

图 1 RNA 电泳图Figure 1 Electrophoretogram of RNA心脏；2：肝脏；3：脾脏；4：肺脏；5：肾脏；6：扁桃体；7：颌下淋巴结；8：肠系膜淋巴结；M：DNA Marker Heart; 2: Liver; 3: Spleen; 4: Lung; 5: Kidney; 6: Tonsil; 7: mandibular lymph nodes; 8: mesenteric lymph nDL 5000 DNA Marker.大蒲莲猪和长白猪各组织中目的基因表达水平qRT-PCR 标准曲线和溶解曲线反转录得到的各组合的 cDNA 等体积混池后，进行 2 倍稀释梯度进行稀释目的基因和三个内参基因的标准曲线、溶解曲线和扩增曲线，各引物扩增示，扩增效率均在合适的范围（90％～110％）内；方程 R2值都接近 1，说好；溶解曲线均是单峰，说明引物特异性强，三个内参基因如图 2、3、4

扩增曲线,内参,标准曲线,基因

图 2 三个内参基因的标准曲线、溶解曲线和扩增曲线Figure 2 Standard Curve, melting Curve and amplification Plots of the three reference genes注：A：PPIA 基因；B：RPL4 基因；C：YWHAZ 基因；（1）：标准曲线；（2）：溶解曲线；（3）：扩增曲线Note:A: PPIAgene, B: RPL4 gene, C: YWHAZ gene. (1): Standard curve, (2): Dissociation Curve, (3):Amplification Plots.

扩增曲线,基因,标准曲线

26图 3 TLRs 基因的标准曲线、溶解曲线和扩增曲线Figure 3 Standard Curve, melting Curve and amplification Plots of the TLRs genes注：A：TLR1 基因；B：TLR2 基因；C：TLR3 基因；D：TLR4 基因；E：TLR5 基因；F：TLR6 基因；G：TLR基因；H： TLR8 基因；I：TLR9 基因；（1）：标准曲线；（2）：溶解曲线；（3）：扩增曲线Note:A: TLR1 gene, B: TLR2 gene, C: TLR3 gene, D: TLR4 gene, E: TLR5 gene, F: TLR6 gene, G: TLR7 gene, H: TLR8gene, I: TLR9 gene. (1): Standard curve, (2): Dissociation Curve, (3):Amplification Plots.

【参考文献】