黄瓜翻译控制肿瘤蛋白CsTCTPs基因启动子的克隆及功能分析

发布时间：2020-07-14 03:52

【摘要】：翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)是一类广泛存在于真核生物中参与生长发育调控的大家族,在响应生物和非生物胁迫中均扮演着重要的角色。TCTP的表达受到转录水平和翻译水平的调控,而启动子是基因转录调控的中心。目前,关于TCTP的研究主要集中在人类和动物体中,对植物TCTP的结构和功能的报道相对较少,对其启动子的研究更是知之甚少。在本试验中,以黄瓜品系B21-a-2-1-2作为材料,结合生物信息学和瞬时表达分析等技术对黄瓜CsTCTPs启动子进行了分离和表征,明确该基因在转录水平上受到多种顺式作用元件的调控,为进一步探索CsTCTPs基因转录调控的表达模式及其调控机制提供依据,同时,对深入了解植物的抗逆性具有重要意义。主要研究结果如下:(1)利用常规PCR技术成功地从黄瓜基因组DNA中分离获得了CsTCTP1和CsTCTP2的启动子序列,并利用生物信息学方法预测了CsTCTP1(-1308 bp到+88 bp)和CsTCTP2(-1305 bp到+69 bp)启动子区顺式作用元件的分布及功能。结果表明,CsTCTPs启动子区均含有保守的TATA-box、CAAT-box等核心启动子元件,以及上游的多种顺式作用元件,如激素应答元件(ABRE、TCA和ERE等)、逆境胁迫应答元件(TC-rich repeats)和光应答元件(G-box)等。(2)根据作用元件在CsTCTP1和CsTCTP2启动子上的位置,分别获得六个不同长度的启动子缺失片段,即:proT1-1.3kb(-1308 bp~+88 bp)、proT1-0.7kb(-714 bp~+88 bp)、proT1-0.3kb(-306 bp~+88 bp)、proT2-1.3kb(-1305 bp~+69 bp)、proT2-0.7kb(-732 bp~+69 bp)、proT2-0.3kb(-324 bp~+69 bp)。(3)利用各个启动子缺失体替换pCAMBIA 1301中的35S启动子,成功构建了载有各个启动子缺失片段的GUS融合载体proT1-1.3kb-GUS、proT1-0.7kb-GUS、proT1-0.3kb-GUS、proT2-1.3kb-GUS、proT2-0.7kb-GUS、proT2-0.3kb-GUS。(4)将构建成功的六个GUS融合载体分别转入农杆菌菌株GV3101中。利用农杆菌注射渗透法瞬时转化烟草,并进行组织化学染色和荧光GUS定量测定。结果表明:CsTCTP1和CsTCTP2的六个启动子缺失片段都具有启动基因表达的功能,并且活性约为35S启动子的3~4倍,其中proT1-0.7kb的活性最强,推测该序列中含有类似增强子的顺式作用元件;而其他启动子序列具有的功能并不明确,有待进一步验证。(5)分别使用不同的外源激素(ABA、SA和ETH)对瞬时转化后的烟草叶片进行处理,24 h后测定启动子活性。结果表明,在ABA处理组中,CsTCTP1的proT1-0.7kb和CsTCTP2的proT2-1.3kb启动子活性均上调,推测该启动子序列中可能含有ABA相关的响应元件;SA和ETH处理组中,CsTCTP1和CsTCTP2的所有启动子片段的活性都有不同程度下降,因此推测SA和ETH可能对CsTCTP1和CsTCTP2启动子均具有负调控的作用。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S642.2
【图文】：

如 CAAT-box、GC-box 等（李峥 2012；Smale et al. 2003）（图1-1）。图 1-1 真核生物基因上游序列Fig.1-1 upstream sequence of Eukaryotic gene

胶电泳对 PCR 产物进行检测，切割目的片段并回胶回收收试剂盒（康为）对目的片段进行胶回收，具体步 溶液保存于-20 ℃ 冰箱待用。分析查找黄瓜 CsTCTP1（Loc101204913）和 CsTCTP2在 CDS 序列（或 ATG）上游约 2000 bp 的碱基序列利用在线软件 BDGP、TSSP 和 PlantCARE 对 CsTC所含的顺式作用元件进行分析预测。因组 DNA 的提取-1-2）叶片基因组 DNA 提取后用 1% 琼脂糖凝胶电示提取的黄瓜基因组 DNA 可用于后续实验。

图 2-2 CsTCTP1 和 CsTCTP2 启动子片段克隆结果：DL5000 DNA marker；1：CsTCTP1 promoter；2：CsTCTP2 prom Amplification results of CsTCTP1 and CsTCTP2 promoter f(M: DL5000 DNAmarker; 1: CsTCTP1 promoter; 2: CsTCTP2 promote4080.C.G.T.G.T.A.G.T.G.A.T.A.T.A.A.A.CaAAgGGaAAgGGtTTcCCaAAaAAtTTtTTaAAaAAtTTcCCaAAtTTaAAcCCtTTtTTaAAtTTaAAgGGgGGaAAaAAaAAaAAtTTcCCtTTaAAcCCcCCtTTtTTtTTaAAtTT120160tTTgGGtTTtTTtTTtTTgGGtTTaAAaAAtTTtTTaAAgGGtTTtTTaAAtTTcCCtTTaAAaAAtTTcCCtTTcCCcCCcCCcCCtTTtTTtTTtTTgGGcCCtTTtTTtTTtTTgGGaAAaAAcCCtTTtTTaAAgGGtTTtTTgGGaAAcCCgGGtTTtTTgGGaAA200240aAAaAAgGGgGGtTTgGGaAAgGGaAAaAAcCCgGGaAAaAAgGGtTTtTTtTTtTTgGGtTTtTTgGGtTTtTTtTTaAAtTTgGG

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本文编号：2754448