葡萄体细胞胚的诱导及VvACS1基因对葡萄的遗传转化

发布时间：2020-07-17 15:02

【摘要】：乙烯合成限速酶是调控乙烯生物合成的关键酶,其主要功能是限制前体物质ACC的合成,进一步影响乙烯的生物合成。乙烯是高等植物体内源激素,在植物的生长发育过程中发挥广泛的作用。同时在呼吸跃变型果实中触发了果实呼吸跃变的开始,促进了果实的成熟衰老,加速果实品质的下降。本课题组前期研究发现‘无核白’中的乙烯合成限速酶基因VvACS1在果梗中具有最高的表达水平。本研究以欧洲葡萄(Vitis vinifera L.)品种‘红地球’和‘无核白’的花药、子房及小花蕾为材料,在愈伤组织诱导培养基PIV、MS1上培养获得胚性愈伤组织,然后用农杆菌介导的遗传转化方法,将欧洲葡萄‘无核白’中克隆得到的VvACS1基因构建过表达载体,转入无核白葡萄受体材料中,并验证VvACS1基因功能。本研究还对比了不同培养条件及品种葡萄体细胞胚发生的效率。具体内容及取得的成果如下:1.诱导得到无核白和红地球胚性愈伤组织。以无核白和红地球的花药、子房和小花蕾为外植体,在MS1培养基(MS+3%蔗糖+1 mg/L 2,4-D+2 mg/L 6-BA+3 g/L植物凝胶)上培养得到胚性愈伤组织。2.对诱导培养基进行改良,发现在CIM6培养基(MS+3%蔗糖+0.5 mg/L 2,4-D+4 mg/L6-BA+1.0 mg/L pic+3 g/L植物凝胶),发现1.0 mg/L毒莠定的添加有助于提高胚性愈伤组织诱导率。3.获得了无核白葡萄的VvACS1转基因株系。采用农杆菌介导法,将携带欧洲葡萄‘无核白’VvACS1基因的过表达载体转入欧洲葡萄无核白的胚性愈伤组织中,并对抗性株系进行PCR检测,验证VvACS1基因被成功整合到受体材料基因组中,获得了34个转基因的无核白葡萄株系。4.选取转基因株系和野生型以内参基因GAPDH进行qRT-PCR。结果表明在转基因株系中,乙烯合成限速酶基因表达量有所不同,部分株系VvACS1基因相对表达量提高。5.在部分转基因株系中,根系生长较野生型植株受到抑制,其叶片VvACS1基因表达量明显增加或叶片ACS酶活和乙烯释放速率显著增加。
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S663.1
【图文】：

无核白,外植体,小花

3 结果与分析3.1 无核白、红地球葡萄外植体的采集与消毒无核白及红地球葡萄外植体的采集与消毒如图 2-1 所示，开花前 7-12 天采集的花序（图2-1 A），去除顶端及底端部分小花蕾，解剖后卡宝染液染色确定单核靠边期（图 2-1 B），确定为单核靠边期后进行消毒处理分别为接种的小花蕾（图 2-1 C），解剖后接种的花药及子房（图 2-1 D）。

非胚性愈伤组织,体细胞胚,水渍,诱导产生

图 2-2 诱导产生愈伤组织类型；A、泡沫状的非胚性愈伤组织 B、松散的非胚性愈伤组织 C、水渍化的非胚性愈伤组织；D 胚性愈伤组织及体细胞胚Fig 2-2 Type of callus; A. Foamy non-embryogenic callus; B. Friable non-embryogenic callus; C. Waterynon-embryogenic callus; D. Embryogenic callus and somatic embryo.3.3 葡萄体细胞胚萌发及成苗

体细胞胚,成苗,子叶胚,原胚

图 2-3 体细胞胚萌发过程及成苗；A、原胚团及各时期胚；B、球形胚时期；C、心形胚时期；D、鱼雷胚时期；E、子叶胚时期；F、胚根伸长；G 、光形态建成；H、体细胞胚成苗Fig 2-3 The germination of somatic embryo; A. proembryonic masses and types of embryo; B. Global embryo; CHearted-shaped embryo; D. Torpedo-shaped embryo; E. Cotyledonary embryo; F. Radicle of embryo; Gphotomorphogenesis; H. Plantlets were formed on planting medium.3.4 红地球的最佳体细胞胚诱导培养基

【参考文献】