芸薹生链格孢Abcdm1基因的克隆及功能初步分析
发布时间：2020-08-08 00:08
【摘要】：芸薹生链格孢(Alternaria brassicicola(Schw.)Wiltshire)侵染导致的黑斑病是十字花科蔬菜生产上的重要病害之一,在蔬菜的田间生长期和储藏期均可危害,严重影响到该类蔬菜的产量、品质和安全性。但是对于其防控至今还未找到非常有效的措施。分生孢子在真菌的致病过程中起着重要的作用,因此查找芸薹生链格孢的产孢相关基因并对产孢机制进行研究,将有助于深入认识其致病机制,从而为病害的防治提供新的策略。本研究对前期构建的芸薹生链格孢转化子库进行了筛选,共得到了19株产孢缺陷突变体,利用Hitail-PCR技术对产孢缺陷突变体的插入位点侧翼序列进行克隆,得到了突变体M85的右翼序列,序列分析显示该右翼序列为酵母转录因子Ndt-80同源基因,命名为Abcdm1(A.brassicicola conidiation-deficiency mutant)。对Abcdm1基因进行了克隆和序列分析,同时根据同源重组原理,采用PEG介导的原生质体转化的方法,获得1个基因敲除突变体ΔAbcdm1和1个回复突变体C,并进行了生物学功能分析,研究结果如下:对芸薹生链格孢转化子库进行了产孢缺陷突变体的筛选,共得到了19株产孢降低的突变体,其中产孢能力完全丧失的有13株,分别M17,M37,M51,M56,M73,M85,M131,M96,M101,M133,M159,M204,M324;产孢能力显著降低的有6株,为M15,M108,M122,M183,M258,M177。Hitail-PCR得到了M85突变体的右翼序列,为酵母转录因子Ndt-80同源基因,命名为Abcdm1。对Abcdm1基因进行了扩增和分析,该基因全长1905 bp,cDNA 1632 bp,编码543个氨基酸,并发现该基因与其它真菌同源性较低。Abcdm1基因参与芸薹生链格孢的菌丝生长调控,突变体ΔAbcdm1气生菌丝变长,呈绒毛状,菌丝纯白,无黑色素,但是突变体菌落生长速度与野生型菌株一致。Abcdm1基因参与调控芸薹生链格孢的产孢,突变体ΔAbcdm1产孢能力完全丧失。Abcdm1基因参与芸薹生链格孢的胁迫调控,突变体ΔAbcdm1对KCl和NaCl敏感性升高,对氧胁迫因子H_2O_2敏感性较低。Abcdm1基因参与体外穿透力的调控,突变体ΔAbcdm1体外穿透能力完全消失,但是致病性与野生型相比无差异。Abcdm1基因参与营养代谢的调控。突变体ΔAbcdm1对碳源和氮源的营养应答的反应不同。在基础培养基上MM上加入葡萄糖之后,我们发现突变体几乎不生长。然而在基础培养基上加入BSA之后,突变体可以进行生长。综上所述,在芸薹生链格孢(A.brassicicola)中Abcdm1基因参与胁迫敏感性的应答、营养代谢的应答和体外穿透力。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.4
【图文】：
图 1. ΔAbcdm1 突变体筛选验证相关的引物设计示意图Fig1. Relative primers locations for Abcdm1 screening verification are indicated on the schematic diagram采用 CTAB 提取转化子全基因组 DNA。根据同源重组原理分析，设计验证引物Abcdm1-YF/hph3、hph1/hph2，引物设计原理如图 1。采用普通 PCR 方法，同时与野生菌对比分析，从而筛选出基因缺失突变体 ΔAbcdm1。2.2.12.3 Southern blot 验证 Abcdm1 基因缺失转化子通过 Southern blot 进一步验证得到的突变体是否是单拷贝。提取野生型菌株和突变菌株的基因组 DNA，经合适的限制性内切酶酶切后进行凝胶电泳，以 hph 引物（hph1/hph2）从质粒 pUCATPH 上扩增 hph 片段（1046 bp）制备探针进行 Southern blot分析。Southern blot 过程参考罗氏地高辛标记及检测试剂盒操作手册（DIG High PrimeDNA 标记及杂交检测试剂盒Ⅱ）。突变体杂交条带为一条时是正确的转化子。(1) 基因组 DNA 的酶切
产孢缺陷突变体的筛选Fig.2Screeningofconidiation-deficiencymutantsM258M204M183M324
26图 3 Hitail-PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析M1：Marker DL2000 ；M2：Marker 2000 plusFig3. Analysis of PCR products by agarose gel electrophoresisM1: Marker DL2000 ; M2: Marker 2000 plus带进行回收测序，其中 M85 菌株测序成功，有效因为浓度太低或者测序双峰而导致测序结果失败，结果显示其包括了 603bp 潮霉素磷酸转移酶载体 侧 序 列 的 422 bp 放 入 芸 薹 生 链 格 孢 全 基.gov/Altbr1/Altbr1.home.html）中进行查询和比对
本文编号：2784730
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.4
【图文】：
图 1. ΔAbcdm1 突变体筛选验证相关的引物设计示意图Fig1. Relative primers locations for Abcdm1 screening verification are indicated on the schematic diagram采用 CTAB 提取转化子全基因组 DNA。根据同源重组原理分析，设计验证引物Abcdm1-YF/hph3、hph1/hph2，引物设计原理如图 1。采用普通 PCR 方法，同时与野生菌对比分析，从而筛选出基因缺失突变体 ΔAbcdm1。2.2.12.3 Southern blot 验证 Abcdm1 基因缺失转化子通过 Southern blot 进一步验证得到的突变体是否是单拷贝。提取野生型菌株和突变菌株的基因组 DNA，经合适的限制性内切酶酶切后进行凝胶电泳，以 hph 引物（hph1/hph2）从质粒 pUCATPH 上扩增 hph 片段（1046 bp）制备探针进行 Southern blot分析。Southern blot 过程参考罗氏地高辛标记及检测试剂盒操作手册（DIG High PrimeDNA 标记及杂交检测试剂盒Ⅱ）。突变体杂交条带为一条时是正确的转化子。(1) 基因组 DNA 的酶切
产孢缺陷突变体的筛选Fig.2Screeningofconidiation-deficiencymutantsM258M204M183M324
26图 3 Hitail-PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析M1：Marker DL2000 ；M2：Marker 2000 plusFig3. Analysis of PCR products by agarose gel electrophoresisM1: Marker DL2000 ; M2: Marker 2000 plus带进行回收测序，其中 M85 菌株测序成功，有效因为浓度太低或者测序双峰而导致测序结果失败，结果显示其包括了 603bp 潮霉素磷酸转移酶载体 侧 序 列 的 422 bp 放 入 芸 薹 生 链 格 孢 全 基.gov/Altbr1/Altbr1.home.html）中进行查询和比对
【参考文献】
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本文编号：2784730
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