水稻穗顶部颖花退化基因PAA1的图位克隆与功能分析

发布时间：2020-08-08 23:27

【摘要】：水稻是重要的粮食作物,为全球大约一半的人口提供主食。水稻每穗粒数是构成产量的重要因素之一。穗大粒多一直是世界水稻育种的主要目标,然而水稻穗顶部颖花退化现象在水稻育种中普遍发生,造成穗子体积减小每穗粒数显著减少,严重影响水稻单产。目前,关于水稻穗顶部小穗退化的遗传和分子机制还知之甚少。本研究以水稻组织培养过程中获得的穗顶部退化突变体paa1为材料,并对顶部颖花发生退化的整个过程进行了详细的观察,通过图位克隆的方法分离并鉴定了一个影响水稻穗顶部退化的关键因子PAA1,并对该基因的功能进行深入的研究,揭示了paa1发生穗顶部颖花退化的分子机制。本文主要研究结果如下:1、与野生型相比,突变体paa1在营养生长时期没有出现明显的表型差异,抽穗以后,突变体的穗顶部小穗发生严重退化,并且穗一直保持直立的形态。籽粒成熟之后,突变体paa1顶部退化的小穗几乎都脱落,导致穗长、穗粒数、千粒重以及株高显著降低,最终对paa1的单株产量造成影响。2、不同发育阶段幼穗形态的观察结果表明paa1的顶部小穗在幼穗伸长后期出现生长停滞,然后逐渐表现为干瘪和发白。细胞学观察表明paa1顶部退化小穗表现为细胞皱缩、细胞器降解以及染色体DNA断裂。paa1顶部小穗中过氧化氢和丙二醛含量均显著升高,诱发细胞程序性死亡的基因OsVPE2和OsVPE3的表达水平显著上调,说明paa1顶部小穗的退化是由于过氧化氢积累引发的细胞程序性死亡造成的。3、利用图位克隆的方法将PAA1精细定位在第2号染色体长臂端的标记C1和H-4之间82 kb的范围内,含9个ORFs,测序发现第6个ORF(LOC_Os02g45160)的第2个内含子与第3个外显子的剪切位点上发生了碱基A→G的替换,结果导致mRNA的剪切发生改变,从而形成了两种异常的转录本,都会造成蛋白质翻译时发生移码并提前终止。转基因互补和干扰实验都可以确定LOC_Os02g45160是引起穗顶部退化的目标基因PAA1。PAA1基因编码一个铝激活的苹果酸转运蛋白,属于水稻ALMT家族的成员。PAA1定位在细胞质膜上,在水稻的根、茎、叶、叶鞘和穗等各个组织中都有不同程度的表达。4、PAA1在二羧酸转运缺陷型菌株中表达可以吸收苹果酸,说明PAA1在大肠杆菌中具有苹果酸转运功能。利用双电极电压钳技术可以在表达PAA1的卵母细胞中检测到明显的苹果酸电流,Al处理后对电流没有影响,说明PAA1在卵母细胞中是一个不依赖于Al的苹果酸通道。外源苹果酸处理水稻幼苗后,PAA1的表达水平显著上调,paa1地上部的苹果酸含量显著降低。孕穗时期,苹果酸含量测定结果表明paa1顶部小穗中的苹果酸积累量显著减少,外源苹果酸注射突变体幼穗能显著减弱顶部退化表明突变体顶部小穗的退化是由苹果酸含量降低引起的。5、水稻幼穗中NAD(H)和NADP(H)含量测定结果显示,paa1顶部小穗细胞内的NADPH、NADP~+和NAD~+含量与野生型相比都显著降低,同时,NADPH/NADP~+比率显著降低,而NADH/NAD~+比率显著升高。这些结果说明突变体顶部小穗细胞内苹果酸含量的降低会引发细胞内的氧化还原平衡遭到破坏,从而有可能导致活性氧(ROS)爆发,引起顶部穗细胞发生死亡。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511;Q943.2
【图文】：

示意图,穗形成,水稻,分生组织

有的大穗型品种有时会出现三次枝梗（tertiary spikelet）（图1.1A）。每个小穗由两个退化的颖片、一对护颖和一个小花组成，小花由外稃、内稃、两个浆片、六枚雄蕊和一个雌蕊组成（Itoh et al., 2005；姜树坤2012）。水稻穗的形成过程非常复杂，涉及到多种分生组织的分化及发育。水稻在幼穗进行分化之前为营养生长时期，当营养生长进行到一定的阶段，外界环境条件与内部因素适合成花诱导时，水稻便进入生殖生长阶段（Wang et al., 2005），首先茎顶端分生组织（shoot apical meristem，SAM）转变成花序分生组织（inflorescence meristem，IM），紧接着花序分生组织便形成一级枝梗分生组织（primary branch meristem, PBM）和花序的主穗轴，形成一定数目的一级枝梗分生组织以后，顶端分生组织便停止发育产生了一个退化点。然后，一级枝梗分生组织形成二级枝梗分生组织（secondary branch meristem, SBM）和小穗分生组织（spikelet meristem, SM;图1.1B）

双突变体,分生组织,小穗

1复合体的泛素化降解实现对水稻分枝的调控（Xu et al., 2012; Lin et al., 2012）。moc1 lax2双突变体表型比单突变体更严重（图1.2L），说明在水稻中MOC1参与另外一中调控分枝的途径，在这条途径中MOC1和LAX2共同调控营养生长和生殖生长时期分枝的形成（Tabuchi et al., 2011）。图 1.2lax2与lax1或moc1的双突变体表型图（Tabuchi et al., 2011）Figure 1.2 Morphology of Double Mutants of lax2 with lax1 or moc1.1.1.2.2 分生组织分化时间的调控水稻花序分生组织（IM）向小穗分生组织（SM）的转变是水稻穗形成过程中的关键步骤。小穗分生组织分化的时间对维持穗的形态起到决定性的作用，若分化的时间延迟，则会导致穗变大、穗粒数增加；相反，小穗分生组织提前分化，则会导致穗变小、穗粒数减少。目前已克隆出一些参与控制分生组织转换时间的基因（Zhang and Yuan, 2014；Pautler et al., 2013）。ABERRANT

突变体,表型,穗部

图 1.3 sp1 突变体的表型（Li et al., 2009）Figure1.3 Phenotype of sp1 mutant和突变体sp1-2抽穗以后的整株和穗部表型比较。（C-D）野生型和突变体sp1-2 comparison between wild type and sp1-2 after heading. (B) Comparison of panicle p

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