【摘要】:背景:心房颤动(atrial fibrillation,AF),简称房颤,是临床常见且具有严重危害的心房异位搏动,其频率在350~600次/min。房颤的病因学研究表明,有部分房颤患者既没有这些传统意义上的发病风险因素,也没有确定的病因;这种原因不明的心房颤动被称为特发性房颤(Idiopathic atrial fibrillation,IAF)。IAF的患者常表现为家族聚集性,故而研究人员推测其发病机制可能与遗传因素相关。KCNA5是一个房颤易感基因,该基因定位于人12号染色体12p13上,可编码Kv1.5钾离子通道的α亚单位。在人类心脏中,Kv1.5特异性表达于心房肌细胞,并介导超速激活延迟整流钾电流(ultra-rapid activated rectifier potassium currents,IKur)电流。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指出现在染色体DNA分子序列上某个特定位点的单个核苷酸的多态性,在一个群体中出现2个及以上的等位基因且基因频率大于或等于百分之一时即可认为具有多态性。目前关于Kv1.5钾离子通道编码基因KCNA5的分析研究在选择样本、个体条件上有许多差异,所得结果也不尽相同,相关研究仍然不足。本研究选取KCNA5基因外显子上位于5'非翻译区(5'-UTR)的rs3741930(C/T)和位于3'非翻译区(3'-UTR)的rs1056468(A/T)位点,通过基因测序、电生理技术等方法比较房颤患者和正常对照人群候选基因位点基因频率与基因型的差异,研究KCNA5基因SNP多态性与房颤的相关关系,以期从分子生物学水平探讨房颤风险基因的单核苷酸多态性是否存在群体差异性,为房颤的诊断和个性化治疗提供新的潜在位点。第一部分IAF患者中KCNA5 SNP位点各等位基因频率的分布情况目的:探讨KCNA5基因上的两个单核苷酸多态性位点rs3741930(C/T)和rs1056468(A/T)等位基因与特发性房颤之间的关系。方法:收集了282例IAF患者作为研究对象,以300例年龄和性别匹配的健康人群作为对照组。每位受试者采集外周血5 mL。提取来自全血细胞的基因组DNA。以基因组DNA为模板进行PCR扩增目的片段。进行目的片段的鉴定、纯化、回收及测序。统计分析房颤患者和正常健康人群中KCNA5 SNP位点等位基因频率的分布情况。结果:rs3741930位点在特发性房颤组和正常健康组的遗传学分布符合H-W平衡;SNP分型检测的结果显示rs3741930的等位位点C、T在特发性房颤组的分布频率分别为(235)41.7%、(329)58.3%,在健康对照组的分布频率分别为(208)34.7%、(392)65.3%;特发性房颤组rs3741930位点等位基因C的分布频率显著高于健康对照组(P=0.014)。rs1056468位点在特发性房颤组和正常健康组的遗传学分布符合H-W平衡;SNP分型检测的结果显示rs3798579等位位点A、T在特发性房颤组的分布频率分别为(387)68.6%、(177)31.4%,在健康对照组的分布频率分别为(384)64%、(216)36%;两组比较,rs1056468位点等位基因A的分布频率在特发性房颤组和正常健康组中的差异不具有统计学意义(P=0.095)。小结:经H-W遗传学平衡定律检测,本研究所选样本具有良好的群体代表性。KCNA5基因中SNP位点rs3741930可作为特发性房颤发病的一个新的风险位点,携带C等位基因的人群更易患房颤。rs1056468位点的单核苷酸多态性与特发性房颤之间无显著联系。第二部分IAF患者中KCNA5 SNP位点的各基因型频率的分布情况目的:探讨KCNA5基因上的两个单核苷酸多态性位点rs3741930(C/T)和rs1056468(A/T)基因型与特发性房颤之间的关系。方法:利用DNA测序技术检测IAF患者和健康对照人群中KCNA5基因SNP位点的各基因型分布频率,并分析IAF患者各项临床指标分别在两个多态性位点rs3741930和rs1056468的不同基因型之间是否存在差异。结果:rs3741930基因SNP多态性位点的三种基因型CC、CT、TT在特发性房颤组的分布频率分别表现为(47)16.7%、(141)50.0%和(94)33.3%,健康组分别为(30)10%、(148)49.3%和(122)40.7%;统计学分析显示纯合子基因型CC分布频率在两组之间的分布具有统计学差异(P0.05);CT、TT基因型分布频率在二组之间的差别不具有统计学意义(P0.05)。rs1056468基因SNP多态性位点的三种基因型AA、AT、TT在特发性房颤的基因分布频率分别表现为(125)44.3%、(137)48.6%和(20)7.1%,正常健康组则分别表现为(116)38.7%、(152)50.7%和(32)10.6%,三种基因型分布频率在二组之间的差别不具有统计学意义(P0.05)。IAF患者的年龄、收缩压、舒张压、心室率、左心房内径以及左室射血分数等临床指标在rs3741930和rs1056468的不同基因型之间的差异无统计学意义(P0.05)。多态位点rs3741930-CC基因型患者的体质指数(BMI)为26.9±2.3 Kg/m~2,而多态位点rs3741930-CT+TT基因型患者的BMI为24.8±2.5 Kg/m~2,两组之间差异具有统计学差异(P=0.019)。多态位点rs1056468-AA基因型患者的BMI为24.9±2.7 Kg/m~2,而多态位点rs1056468-AT+TT基因型患者的BMI为26.4±2.4 Kg/m~2,两组之间差异具有统计学差异(P=0.014)。小结:KCNA5基因中SNP位点rs3741930与特发性房颤存在相关性,携带CC基因型的人群更易患房颤。在IAF患者中KCNA基因多态位点rs3741930和rs1056468的不同基因型之间患者的体重指数存在差异。第三部分KCNA5基因SNP位点rs3741930等位基因C和T对Kv1.5电流的影响目的:制备异源表达体系,以进一步验证KCNA5多态性位点rs3741930与特发性房颤之间的关系。方法:使用基因工程技术将含有rs3741930多态性位点的KCNA5基因的表达载体转染入HEK293细胞中制备异源性表达体系,并使用全细胞膜片钳技术进行Ikur测定,以评估rs3741930位点不同等位基因对Ikur的影响。结果:全细胞膜片钳结果显示,rs3741930位点T等位基因组60mV处的Ikur的电流密度为45.36±7.79 pA/pF(n=13),而C等位基因组则降至为39.52±4.74 pA/pF(n=11),两组差异具有统计学意义(P=0.0416)。以+60mV的电流作为100%进行标准化,观测电流-电压曲线的形态,可发现两种HEK293细胞的电流-电压曲线的形态高度重合。小结:Ikur的电压依赖特性没有发生转变,C等位基因组中Ikur较T等位基因组减少的原因可能是细胞膜上KCNA5蛋白表达数目减少所致,而非蛋白链结构发生改变所致。结论:KCNA5基因中SNP位点rs3741930与特发性房颤存在相关,携带携带C等位基因及CC基因型的人群更易患房颤。其主要原因可能是C等位基因组较T等位基因组细胞膜上KCNA5蛋白表达数目减少,Ikur降低。在IAF患者中KCNA5基因多态位点rs3741930和rs1056468的不同基因型之间患者的体重指数存在差异。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R541.75
【图文】: pMD18-T-KCNA5重组质粒转化子细胞中KCNA5基因的PCR扩增
图 3 pcDNA3.1-T2A-EGFP 表达载体图谱g.3 The expression vector map of pcDNA3.1-T2The gene insertion site is marked with narrow.100μ m
pcDNA3.1-T2A-EGFP 表达载体xpression vector map of pcDNA3e insertion site is marked with na
【参考文献】
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本文编号:
2790277
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