柠条锦鸡儿Ckγ-ECS基因抗旱功能研究

发布时间：2020-08-13 22:09

【摘要】：干旱是导致我国荒漠化和沙土化的主要原因,尤其在西北地区更为明显。干旱环境引起植物体内氧化还原异常,影响植物正常生长发育。叶片是植物发生同化和蒸腾过程的主要器官,叶片表皮气孔的变化是旱区植物长期适应干旱的重要方式之一。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)是谷胱甘肽合成的限速酶,谷胱甘肽是重要的硫醇化合物,在植物响应干旱胁迫过程中发挥重要作用。谷胱甘肽会影响生长素输出载体的水平,从而调节生长素在根部的分布。研究表明气孔发育也受到生长素的调控,从而影响植物的抗逆能力。柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii Kom.)是分布于我国西北地区典型的豆科灌木,由于其良好的适应性,是我国干旱地区水土保持和防风固沙的主要树种之一。目前对柠条锦鸡儿Ckγ-ECS基因影响抗旱性分析在分子水平研究较少,因此本研究主要开展柠条Ckγ-ECS的功能研究,揭示该基因如何通过生长素影响气孔发育的分子机制,对旱区植物干旱适应性研究具有重要的理论和实践意义。主要的试验结果包括:(1)从安塞,神木和东胜三个降雨量依次降低的地区采样,气孔密度与降水量呈正相关,表明气孔密度降低可能是柠条适应干旱的重要方式。用不同浓度PEG6000处理,柠条主根随PEG6000浓度增加呈增长趋势,根冠比增加,植株高度和叶片面积均呈降低趋势,表明干旱环境下促进柠条根系伸长,而抑制地上部分生长。qRT-PCR分析表明,气孔发育相关基因CkFAMA和CkSTOMAGEN转录水平随干旱程度加重呈下降趋势,生长素相关基因CkAXR3和CkARF5表达量升高。Ckγ-ECS基因表达及酶活性都显著增加,表明Ckγ-ECS能及时响应干旱胁迫。以上结果表明:干旱处理后柠条形态建成更有利于适应干旱环境,并且诱导Ckγ-ECS基因大量表达,生长素相关基因表达上调,气孔发育相关基因表达下调。(2)从柠条中克隆Ckγ-ECS基因的cDNA序列全长为1527bp,编码508个氨基酸,分子量57.59kDa。利用农杆菌介导浸染拟南芥获得过表达Ckγ-ECS植株,通过RT-PCR和Western Blotting鉴定阳性植株。(3)与野生型相比,主根较长,过表达拟南芥幼苗叶面积呈降低趋势,叶片细长;通过扫描电镜观察叶片表皮,发现气孔密度和气孔开度都降低。与野生型相比,过表达拟南芥γ-ECS酶活性显著增强,AtAXR3和AtARF5在过表达拟南芥中表达量提高,表明过表达Ckγ-ECS影响了生长素信号通路中基因表达。AtFAMA和AtSTOMAGEN转录水平表达较低,AtEPF1表达上调,表明过表达Ckγ-ECS对气孔发育产生影响。以上结果表明Ckγ-ECS基因可能通过生长素信号负调控气孔发育。(4)干旱胁迫下,过表达拟南芥植株生长能力更强,叶片含水量较高,失水率及丙二醛含量较低。表明过表达Ckγ-ECS增强了拟南芥保水能力,提高拟南芥抗旱性。综上,我们推测柠条Ckγ-ECS基因可能通过影响生长素途径影响气孔发育,通过负调控降低气孔密度,提高植物抗旱性。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2
【图文】：

谷胱甘肽合成,途径

第一章文献综述第一章文献综述1 植物 γ-ECS 研究进展γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)是谷胱甘肽(GSH)合成的限速酶，在有机体中 G两步依赖 ATP 的代谢途径合成，首先由 γ-ECS 催化谷氨酸(Glu)和半胱氨酸(Cys)生谷氨酰半胱氨酸(γ-EC)，再加一分子甘氨酸，经过谷胱甘肽合成酶(GS)催化形成谷肽(Garcia-Gimenez et al. 2013)，同时谷胱甘肽以反馈抑制影响 γ-ECS 的酶活性，并活性也受到环境因素的制约（图 1-1）。在拟南芥细胞中γ-ECS 主要分布于叶绿体和体，对植物生长发育是不可缺少的，拟南芥中 γ-ECS 功能性缺失导致胚致死(Hellrgmann 1990; Cairns et al. 2006)。GSH 主要维持体内氧化还原平衡，在谷胱甘肽缺变体 cad2-1 中 γ-ECS 活性显著下降，严重影响植物生长发育(Cobbett et al. 1998)。H 突变体拟南芥中发现，花的生长发育受到明显的影响，同时根尖中生长素含量降明 GSH 以正调节因子参与生长素对植物生长发育的影响过程(Bashandyetal. 2010

过程图,过程,气孔,保卫细胞

1.2.1气孔是植物组织与环境进行碳循环及水循环的主要通道，由两个保卫细胞(GC)构气孔变化是植物响应干旱的特征之一。气孔发育过程中由表皮细胞通过两次分裂发（不对称分裂和对称分裂），形成保卫细胞母细胞(GMC)和保卫细胞，从而形成成熟气孔(Geisler et al. 2000)。气孔发育主要受保卫细胞的膨胀运动，细胞生长及分化的影(Franks et al. 1998; Pandey et al. 2007)。气孔形成过程主要依赖三个 bHLH 类转录因即 SPEECHLESS（SPCH），MUTE 和FAMA（图 1-2）。SPCH 促进表皮细胞进入分化态并放大该信号(MacAlister et al. 2007)；MUTE 促进拟分生组织细胞向保卫细胞母细的转化(Pillitteri et al. 2007)；FAMA调控保卫细胞母细胞的对称分裂并形成成熟的保细胞(Ohashi-Ito and Bergmann 2006)。过表达或功能性缺失这些转录因子都会引起气孔育异常，过表达 SPCH 基因时，植物会产生大量气孔，说明 SPCH在不对称分裂过程起关键作用(MacAlister et al. 2007)；过表达 MUTE 基因时，几乎全部的表皮细胞发育气孔，认为 MUTE 可以结束不对称分裂，促进形成 GMC；FAMA主要调控成熟保卫胞，形成气孔，缺失 FAMA 功能时，会引起GC 异常分化，无法形成正常的气孔(Ohashiand Bergmann 2006)。

调节过程,生长素,蛋白,生长素结合蛋白

图 1-3 气孔发育中的调节过程(Hamanishi et al. 2012)Fig 1-3 The stomatal development signalling network物生长发育及响应胁迫中最广泛的植物激素(要通过 Aux/IAA 和 ARFs 蛋白活性诱导生长素uzroud et al. 2018; Chapman and Estelle 2009; G别（图 1-4）：位于细胞膜的生长素结合蛋白 /生长素结合 F-box(AFB)蛋白(Hayashi 2012)。T蛋白，生长素浓度较高时，促进TIR1/AFB 和解 AUX/IAA蛋白，激活 ARFs 活性(Gray et l. 2007)；生长素浓度低时，AUX/IAA 抑制 ARF信号转导过程中，干旱胁迫下，会影响 Aux/I09), 大豆(Ha et al. 2013a)及鹰嘴豆(Singh et alA成员表达上调，在水稻中有15个IAA基因表

【参考文献】