Ku基因和条件致死基因codA在衣藻基因编辑中的应用研究

发布时间：2020-08-17 08:30

【摘要】：莱茵衣藻作为模式物种,在微藻研究中广泛使用。它是目前唯一能在细胞核、叶绿体和线粒体三套遗传系统中都能进行转化的真核藻类。虽然莱茵衣藻的细胞核转化体系已经较成熟,外源DNA分子能高效整合入细胞核基因组中,但这种整合是随机插入为主。到目前为止莱茵衣藻核基因的定向敲除、替换技术尚未有效建立,如何高效进行基因组特定区域DNA的插入、敲除和替换?成为莱茵衣藻基因编辑的瓶颈。针对莱茵衣藻同源重组效率低的问题,本论文从Ku基因和条件致死基因codA两方面进行研究,探讨衣藻内源Ku基因敲除/失活对其核基组同源重组的影响,探索在莱茵衣藻利用codA进行反向筛选的可能性。实验结果表明:我们能够在内源Ku基因失活藻株的maa7位点整合外源基因,初步完成了基因编辑;codA转基因工程藻生长基本不受影响,仅在5-FC的诱导下死亡,说明了莱茵衣藻反向筛选的可行性。这些均为莱茵衣藻定向编辑技术体系的建立奠定研究基础。具体研究结果如下:1.根据莱茵衣藻密码子偏好性改造大肠杆菌codA基因,获得了长度为1311bp的优化基因(crcodA),并构建了含有热诱导启动子的pJ1D-crcodA表达载体,通过“珠磨法”转入莱茵衣藻CC849细胞核中,经过PCR和测序验证,获得了工程藻codA1和codA3。荧光定量PCR结果表明codA基因在工程藻codA3中的表达量要高于在工程藻codA1中,且热诱导使其在工程藻中表达量提高约1倍。采用5-FC作为致死诱导物的研究发现,当5-FC浓度达到5 mg/mL时会对工程藻产生毒性,并且毒性强弱与藻细胞浓度有关,仅当藻细胞浓度低于8×10~2 cells/m L时,5-FC会导致工程藻codA3细胞死亡。叶绿素含量检测发现5-FC致死诱导后工程藻的叶绿素含量显著降低,较野生型低1倍左右,但热诱导并未对工程藻的叶绿素含量造成显著改变,表明热诱导对5-FC的致死诱导效果影响不大。2.为提高codA在衣藻中的致死效果,用组成型启动子PsaD替换热诱导启动子Hsp70-RBCS2,并进一步构建了crcodA+crupp基因的融合表达载体pDb-crcodAupp。首先根据莱茵衣藻密码子偏好性改造大肠杆菌upp基因,获得了长度为648bp的优化基因(crupp),接着构建了pDb-crcodAupp表达载体,最后通过“珠磨法”将其转入莱茵衣藻细胞核中,获得了高融合表达crcodAupp基因的工程藻upp1和upp2。5-FC致死诱导研究表明,当5-FC浓度为5 mg/mL时会对工程藻产生毒性,当藻细胞浓度低于1×10~5cells/mL时工程藻的生长被显著抑制,而藻细胞浓度低于1×10~3 cells/mL时,所有工程藻都死亡。这表明经改良后codA基因能使莱茵衣藻在特定条件下(添加5-FC)完全死亡,证明利用codA在莱茵衣藻中进行反向筛选是可行的。3.在莱茵衣藻基因组中预测了两个Ku类蛋白基因crKu70,crKu80,并从衣藻突变库中筛选出可能的crKu70,crKu80失活突变藻dKU70和dKU80。划线纯化可能的失活突变藻后,以PCR测序检测它们的基因型。结果显示藻株dKU70基因组在crKu70基因的第8个内含子中发生了外源抗性基因(CIB1 cassette)的反向插入,且抗性基因在插入时丢失了3'末端265个碱基;藻株dKU80基因组在cr Ku80基因的第5个外显子中发生了整个抗性基因的正向插入。该结果从基因水平证实藻株dKU70和dKU80确为内源cr Ku70,cr Ku80失活的突变藻。因Ku类蛋白与DNA损伤修复有关,藻株dKU70和dKU80均对DNA损伤剂敏感,但dKU80较dKU70更敏感。该结果从功能角度进一步验证dKU70和dKU80为内源Ku类基因失活藻。鉴于dKU80的表型更明显,选择该藻进行后续基因编辑研究。4.选取莱茵衣藻内源maa7基因为靶基因,构建了同源重组载体pMD19T-maa7LRhyg,该载体含有由maa7上游1kb、潮霉素抗性基因、maa7下游1kb组成的重组单元。重组载体转化藻株dKU80,通过潮霉素和5-氟吲哚筛选获得转化子。转化子的PCR检测表明,同源重组单元成功在藻株dKU80的maa7基因处发生了基因替换。该结果初步证实内源Ku80基因失活藻株能够在特定位置进行定向基因编辑。综上所述,一方面本研究利用基因工程手段获得了crcodA+crupp基因融合表达的工程藻,证实了codA基因在莱茵衣藻核基因编辑中作为反向筛选标记的可行性;另一方面获得了内源Ku类蛋白失活的突变藻,证实通过同源重组载体的方式能够在crKu80失活藻中初步实现基因组定向编辑。本论文为莱茵衣藻的同源重组技术的开发提供了有益探索,开拓了新思路,为莱茵衣藻定向编辑技术体系的建立奠定基础。
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2
【图文】：

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图 1-1 ZFNs 作用原理示意图（Carlson[4]) 转录激化效应核酸酶技术转录激化效应核酸酶(transcription activator-like effectors nucleases, TALENss 的替代物已成为植物中有效的基因组编辑工具。原则上，TALENs 与 ZFNs利用 DNA 双链断裂来进行基因编辑（图 1-2）[15]。此外，TALENs 与 ZFNs有非特异性 Fok I 核酸内切酶。然而，TALENs 是由 ZFNs 的 Fok I 切割结构域转录激化效应物（TALE）高度保守且重复的特定 DNA 结合结构域融合形成ENs 蛋白是在黄单胞杆菌中发现的，其分泌的 TALE 可以改变宿主植物中的基, 18]。TALE 的 DNA 结合结构域包含高达 30 个拷贝的 33-34 个氨基酸序列且高除了第 12 和 13 位置上的氨基酸。第 12 位和第 13 位氨基酸被称为重复可变双基序列（repeat-variable diresidue ,RVD），与特定的核苷酸识别具有实质相关性复序列都可以识别单个碱基，因此可以为任何 DNA 序列组装新的结合位点[1

示意图,作用原理,示意图,核酸酶

图 1-2 TALENs 作用原理示意图（Mahfouz[15]）1.1.3 成簇的规律间隔短回文重复序列成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/ Cas 是细菌中常见的 DNA 序列家族其包含入侵细菌的病毒 DNA 片段，这些 DNA 片段可以被细菌用来识别和破坏 DNA其免受进一步的攻击，从而保护自己[24]。 CRISPR / Cas 可以充当细菌的免疫系统，细菌提供抵抗外来遗传物质的抗性。CRISPR 系统包括 CRISPR RNA（crRNA），反激活 CRISPR RNA（tracrRNA），Cas9 核酸酶和原型间隔区相邻基序（PAM）。天然在的 CRISPR 系统是将外源 DNA 序列整合到 CRISPR 簇中，然后，含有外源 DNA列的 CRISPR 簇产生与其位点互补的 PAM 区的 crRNA（约 40nt）。 crRNA 与 tracrR杂交形成 guide RNA（gRNA）。gRNA 激活 Cas9 系统并结合 Cas9。gRNA 5' 末端20 个核苷酸指导 Cas9 核酸酶与靶 DNA 进行碱基互补配对，从而导致 RNA-DNA 互

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图 1-3 CRISPR / Cas9 作用原理示意图（Sander[25]）.2 同源重组同源重组 (homologous recombination, HR) 技术是基因工程研究方面技术手段，在基因克隆和基因打靶方面起着重要作用。在 DNA 同源序生 HR，此外近乎所有的生物体中都会发生 HR，如真核生物中发生的之间的交换，姐妹染色单体之间的交换，细菌以及某些低等真核生物的导，接合，噬菌体的重组等都属于此类重组方式[40]。另外，HR 还经链断裂的细胞中，是双链断裂修复中一种重要的修复模式，对基因组具有举足轻重的地位。RecA 重组系统是大肠杆菌自身携带的，由 RecA 家族蛋白和 RecB。其中 RecA 基因编码的 RecA 蛋白是 RecA 家族蛋白的第一个成员，

【参考文献】