大蒲莲猪Nrf2基因克

发布时间：2020-08-17 20:41

【摘要】：随着生活质量的提高和消费理念的转变,人们对猪肉的品质有了更高的要求,生产过程中,氧化应激是产生PSE等劣质肉的重要原因。不同猪种个体肌肉组织抗氧化能力差异显著,地方猪种与引进猪种也拥有不同的抗氧化能力。核因子Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor)作为重要的转录调节因子,在调节机体内氧化水平、抗氧化、维护机体正常生理功能方面具有重要作用,且已成为抗氧化应激的重要调控因子。为了解不同猪种间骨骼肌抗氧化能力,同时进一步认识Nrf2基因的结构与功能,探究Nrf2基因转录调控机制,本试验进行了如下研究:1.通过对大蒲莲猪、烟台黑猪、五莲黑猪、里岔黑猪、沂蒙黑猪、杜长大三元杂交猪骨骼肌SOD活性、MDA含量和T-AOC的检测,发现大蒲莲猪SOD活性和总抗氧化能力T-AOC除与烟台黑猪差异不显著(P0.05)外,与其他猪种差异显著(P0.05);大蒲莲猪丙二醛(MDA)含量与五莲黑猪、烟台黑猪差异不显著(P0.05),与其他猪种差异显著(P0.05)。表明大蒲莲猪骨骼肌有较强的抗氧化能力,为后续试验提供基础。2.使用RACE技术克隆获得了大蒲莲猪Nrf2基因的完整cDNA序列,使用生物信息学技术,分析和预测基因的结构和功能。Nrf2基因cDNA全长2358bp,5'UTR87bp,3'UTR495bp。其中CDS区为1776bp,编码591个氨基酸。Nrf2蛋白分子量66.4027kDa,理论等电点:pI=4.66,二级结构大部分为α螺旋,无跨膜区,不是分泌蛋白。核苷酸序列与氨基酸序列均与人同源性最高。3.在mRNA水平上,Nrf2广泛存在于组织和细胞中,在肌肉、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏中均可检测到,且在肾脏和心脏之间存在明显的表达差异(P0.05)。在肾脏、肺脏和肌肉中表达较高,在心脏中表达最低。在大蒲莲猪和长白猪肌肉中Nrf2基因表达量存在显著差异(P0.05)。这表明肾脏在猪抗氧化应激中发挥重要作用;而肌肉、肾脏和肺脏在大蒲莲猪抗氧化应激中发挥重要功能。4.使用染色体步移技术从大蒲莲猪基因组克隆得到Nrf2基因5'侧翼2091bp的片段,Nrf2基因5'侧翼区经预测含有典型的TATA-box,不含CpG岛。通过巢式PCR方法以不同上游引物来获得不同长度的启动子系列片段,并将这些片段连接到pGL3-Basic载体中,将重组载体和内参质粒共转染进293T细胞,48小时后收集细胞,检测荧光素酶活性。结果表明-903bp~-710bp区域内可能存在正调控区或增强子;分析其中存在多个转录因子结合位点,研究结果提示,这些位点可能是参与Nrf2基因转录调控的重要序列。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S828
【图文】：

大蒲莲猪Nrf2基因克

转录复合体的结构(Carey,1998)

原理图,原理,染色体步移,技术

图 2 SYBR GREEN 1 原理Fig. 2 Principle of SYBR GREEN 1移技术（Genome Walking Technique）移技术（Genome Walking）是一种建立于 PCR 基础上的分子生种技术可以快速获取与已知序列相邻的未知序列。染色体步移技据已知的基因序列连续步移，获取人或动物的重要调控基因序表达调控，如：克隆启动子并对其功能进行研究。我们可以轻易到人、小鼠、拟南芥等已知序列的侧翼序列，但在清楚目的基知道一个已知序列区域旁的 DNA 序列，染色体步移技术无疑是等，2006）。的 TAIL-PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR）技术（Liu e交错 PCR，与反向 PCR 法、连接接头法等传统的染色体步移技

电泳图,电泳图,中间片,片段

图 4 总 RNA 电泳图 (M:DL2000 DNA Marker)Fig. 4 Electrophoretogram of total RNAACE 和中间片段扩增肉组织的总 RNA 为模板，反转录得到 cDNA，分别进的 PCR 扩增。结果见图 5。扩增部分的中间片段约 6约 390bp 的条带（图 5B），3'RACE 扩增获得了约 60段序列与预期片段大小相符。 2 M2 1 2 M2400bp300bp700bp500bp

【参考文献】