基于DNA纳米蝎的肿瘤细胞内基因沉默新方法研究

发布时间：2020-08-20 21:16

【摘要】：癌症正逐渐成为威胁人类健康的一大隐患,其传统治疗方式主要是手术以及放化疗。这些治疗方法虽然挽救了无数生命,但也面临着手术禁忌症、预后不良等多种挑战,因此癌症治疗新方法仍是亟待探索研究的重要领域。近年来,高效精准的基因治疗方法在肿瘤治疗中正发挥着重要的作用。因此,本课题设计了一种适配体和DNA酶共同作用的多功能DNA纳米蝎的纳米结构(称为AptDzy-DNS),用于在肿瘤细胞中高效靶向递送并进行基因治疗。设计自组装的纳米蝎其功能类似于“蝎子”,它的头部包含了特定的适配体形成“蝎刺”,通过与细胞表面的适配体受体特异性结合从而靶向识别肿瘤细胞,两臂末端的DNA酶形成“蝎钳”,在Mg~(2+)的协助下,完成对靶mRNA的剪切。在基因沉默过程中,剪切后的mRNA不能完成相应的蛋白质翻译,阻止癌细胞生长从而实现基因沉默。结果表明,多功能纳米蝎不仅能完成对SK-BR-3和MDA-MB-231两种乳腺癌细胞的特异性识别,而且通过RT-PCR和Western blot试验中,mRNA含量的降低及蛋白表达量的减少显示了对靶向肿瘤细胞的治疗作用。因此,本研究为肿瘤细胞靶向治疗提供了新思路,也显示了纳米蝎在人类癌症靶向治疗中的极大应用前景。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.5
【图文】：

11图 1 (A)自组装的纳米蝎, (B) 纳米蝎靶向传递过程, (C) 纳米蝎介导的基因治疗示意图Fig. 1 (A) Assembly of AptDzy-DNS (B) Targeted delivery methods. (C) Schematicillustration of AptDzy-DNS mediated highly efficient gene therapy.2.2 多功能纳米蝎的表征本次实验所使用的多功能纳米蝎的合成是在此前工作的基础上改良所得[36]。我们首先用到了 6%的聚苯稀酰胺凝胶电泳（PAGE）以验证十条核苷酸链是否成功组装（图 2A）。在图 2A 泳道 1 大于 200 个碱基对的位置可以看到一条明亮干净的条带，指示完整纳米蝎（包括核苷酸链 1-9 和设定链 10）的成功合成。同时，在图 2A 泳道 2 大于 200 个碱基对的位置也出现了一条明亮干净的条带，这个混合物只加入了核苷酸链 1-9，并无设定链，由于含更少的碱基对，该条带比泳道 1 条

图 2 纳米蝎自组装的表征。（A）纳米蝎自组装的 PAGE 电泳分析。 左侧为 DNA 标记，泳道1-2 代表关闭状态的纳米蝎和打开状态的纳米蝎。 （B）纳米蝎的 AFM 图像。 相位图像，比例尺为 300 纳米。Fig. 2 Characterization of AptDzy-DNS self-assembly. (A) PAGE analysis of AptDzy-DNSself-assembly. Lanes 1-2 represent closed AptDzy-DNS and opened AptDzy-DNS, and Mrepresents DNA ladder marker. (B) AFM image of AptDzy-DNS. Phase image, the scale bar is300 nm.2.3 细胞外纳米蝎剪切活性的可行性分析组装好的纳米蝎与合成的靶序列 HER2 mRNA 于缓冲液中混合后，通过荧光实验来验证纳米蝎两臂的 DNA 酶对 HER2 mRNA 的剪切效果。此处， HER2mRNA 的 5'端和 3'端分别标记了荧光基团（FITC）和淬灭基团（BHQ1）（图 3A）。图 3A 中, 在 HER2 mRNA 存在时, 纳米蝎的两臂末端能与 HER2 mRNA 杂交形2+

重庆医科大学硕士研究生学位论文荧光，如果没有纳米蝎与 HER2 mRNA 杂交，就没有可观测到的剪切后的荧光号（图 3B）。图 3C 中，我们也做了更有趣的实验对比我们此前工作中[36]的两种组装结构的纳米蝎的剪切效果。我们验证了打开状态的纳米蝎（包含核酸链 和设定链 10）和关闭状态的纳米蝎（只包含核酸链 1-9）对 HER2 mRNA 的剪效果，结果显示打开状态的纳米蝎荧光强度更大，预示着这种结构更有利于剪mRNA，所以实验中均采用了这种打开状态的纳米蝎。此外，我们还发现在使DNA 酶时，在两臂使用两种不同的 DNA 酶（DNA 酶 10-23 和 DNA 酶 8-17）在两臂使用相同的 DNA 酶的效果更好。这个现象可能归因于 DNA 酶 10-23 与 8-17 能提供更多的结合 mRNA 的位点，与 mRNA 的结合更加充分。

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本文编号：2798453