褐飞虱线粒体自噬相关基因的克隆与功能研究

发布时间：2020-08-21 07:17

【摘要】：褐飞虱(Nilaparvata lugens St?l)是一种水稻单食性害虫,具有迁飞性、繁殖力强等特点,经常给水稻生产造成巨大的损失。我们在研究褐飞虱与抗性水稻互作的过程中,发现线粒体相关基因和通路发生了不同程度的差异表达。线粒体在ATP合成、氧化应激、钙信号传递和细胞凋亡等生命活动过程发挥重要作用。线粒体自噬(mitophagy)是细胞通过自噬选择性降解线粒体的过程,可以清除功能失调的线粒体。线粒体自噬是细胞的一种自稳态调控和适应机制。但线粒体自噬与褐飞虱适应抗性水稻的关系并未见报道。因此,鉴定褐飞虱中自噬相关基因,研究其在褐飞虱中的表达规律及功能,有助于进一步揭示线粒体自噬在褐飞虱适应抗性水稻中的作用。本研究克隆了褐飞虱线粒体ATP合酶ɑ亚基和β亚基的编码基因(NlATPSɑ和NlATPSβ)以及ATG8泛素结合通路中的3个自噬相关基因(NlATG3、NlATG4和NlATG8),采用荧光定量PCR技术检测了上述基因在褐飞虱不同发育阶段、不同性别或不同组织部位中的表达规律,采用RNA干扰(RNAi)技术研究了NlATPSɑ、NlATPSβ、NlATG3和NlATG4等基因的功能。研究结果如下:一、褐飞虱NlATPSɑ和NlATPSβ的克隆及功能研究利用RACE技术克隆得到NlATPSɑ基因2131 bp的全长cDNA,其1656 bp的开放阅读框编码551个氨基酸;NlATPSβ基因1578 bp的开放阅读框编码525个氨基酸。荧光定量PCR检测发现,NlATPSɑ和NlATPSβ基因的表达规律相似:2个基因在不同发育阶段均有表达,且在若虫期的表达量要高于成虫期;另外,NlATPSɑ和NlATPSβ基因在雄虫中的表达量远高于雌虫,二者之间的差异达到了极显著水平(P0.01)。采用注射法对NlATPSɑ和NlATPSβ基因进行RNA干扰,结果发现两个基因在干扰后的第4天,干扰组的表达量均明显下降,与对照组达到极显著差异(P0.01),RNAi可以导致虫体ATP含量的减少,造成一定数量的试虫死亡,到第7天时的存活率分别下降为对照的45%和40%。二、褐飞虱自噬相关基因NlATG3、NlATG4和NlATG8的克隆及功能研究利用RACE技术克隆获得NlATG3、NlATG4和NlATG8基因的cDNA,其中,NlATG3基因990 bp的开放阅读框编码329个氨基酸,NlATG4基因1140 bp的开放阅读框编码379个氨基酸,NlATG8基因360 bp的开放阅读框编码119个氨基酸。荧光定量PCR检测发现,NlATG3、NlATG4和NlATG8基因在不用发育阶段和不同性别间的表达规律相似:3个基因在不同发育阶段均有表达,且在若虫期的表达量要高于成虫期;另外,NlATG3和NlATG8基因的表达量在雄虫中的表达量远高于雌虫,二者之间的差异达到了极显著水平(P0.01),NlATG4基因的在雄虫中的表达量远高于雌虫,二者之间的差异达到了显著水平(P0.05)。在褐飞虱不同组织部位中的表达规律各不相同:NlATG3基因在不同组织部位中均有表达,且在头部的表达量最低;NlATG4基因在不同组织部位中均有表达,而在胸部的表达量远远高于其他组织;NlATG8基因在胸部基本不表达。采用注射法对NlATG3和NlATG4基因进行RNA干扰,结果发现在干扰后的第4天,2个基因的表达量均大幅下降,与对照组达到极显著差异(P0.01);RNAi可以导致虫体ATP含量的减少;NlATG4基因RNAi后,试虫的组织细胞形态发生了明显的变化,中肠细胞出现了明显的空泡化,靠近肠绒毛的线粒体的形态结构较对照组显得十分模糊,脂肪体间的组织结构完整性受到破坏,且其体内的菌的界限不清晰;NlATG3基因RNAi后的试虫死亡明显,第7天的存活率不到10%,而NlATG4基因RNAi后的第7天存活率下降为对照的50%。综上,本研究克隆、鉴定了部分线粒体自噬相关的基因,明确了目标基因的表达规律,初步研究了目标基因的功能。研究结果为进一步揭示线粒体自噬在褐飞虱中的作用奠定了基础,为褐飞虱的防治提供了新的思路和潜在靶标。
【学位授予单位】：中国计量大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.112.3
【图文】：

图 1.1 自噬的分类[25]自噬相关基因噬相关基因（autophagy-related gene, Atg）是细胞自噬过程中的关最先是在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中发现的[30]。Atg对保守的，在酵母中发现的 38 个 ATG 基因，近一半可以在哺乳动到其同源蛋白[31]。自噬相关基因可以根据其在自噬过程中所发挥的为以下几类：1）Atg1/ULK 复合物（Atg1, Atg11, Atg13, Atg17, A是调控诱导自噬体形成的起始复合物；2）Atg9 及其循环系统（At18）在 Atg1 复合物组装到 PAS 后吞噬泡的扩大运输上起了很大的3 激酶（PtdIns 3K）复合物（Vps34, Vps15, Vps30/Atg6, 和 Atg1成核阶段发挥作用，涉及 PtdIns3P 结合蛋白招募到 PAS 上；4）两统：Atg12（Atg5, Atg7, Atg10, Atg12 和 Atg16）和 Atg8（Atg3, At8）结合系统在囊泡扩张过程中起到重要作用[32]。

模型图,自噬,酵母细胞,模型

2 ubiquitinnjugationsystemAtg5autophagosome formation[67-68]; Phosphorylation of results in impaired autophagy[69]; regulates plasmadifferentiation[70]Atg7E1-like enzyme, is essential for the two impubiquitination-like conjugation system, the formatiautophagosomes, and starvation-induced degradatioproteins and organelles[62-64]Atg10 E2-like enzyme[71]; Conjugates Atg12 to Atg5[72]Atg16Interacts with Atg12 and Atg5, is absolutely requirautophagy induction by affecting the formatioautophagosomes[73-74]3 自噬过程及检测方法自噬的发生可以分为以下五个阶段：1）自噬的诱导，2）吞噬泡的成核泡的延伸与自噬体的形成，4）对接和融合，5）降解和流出[75]（图 1.2自噬发生的因素有很多，例如营养饥饿、缺氧或是各种化学试剂如雷帕都会诱导自噬发生，其中氨基酸饥饿是最有效的[76-77]。

电泳图,电泳图,氨基酸,结构域

图 2.1 PCR 扩增电泳图注：A 图，NlATPSɑ 核心验证； B 图，NlATPSɑ RACE 扩增；C 图，NlATPSβ 全长序列.2.7.2 褐飞虱NlATPSɑ 和NlATPSβ 基因的cDNA全长序列及其编码的氨基酸序列分析使用 ORF Finder 分析发现，NlATPSɑ 基因 cDNA 的全长为 2131 bp，包括38 bp 的 5’非编码区（5’UTR），编码 551 个氨基酸的 1656 bp 开放阅读框（ORF）和434 bp 的 3’非编码区（3’UTR），且3’端有典型的polyA 结构（图 2.2）。NlATPSβ基因的 1578 bp 开放阅读框编码 525 个氨基酸（图 2.3）。ExPASy 软件分析发现NlATPSɑ 基因编码的蛋白分子量为 59.57 kDa，等电点（pI）为 9.03；NlATPSβ 基因编码的蛋白分子量为 56.02 kDa，等电点（pI）为 5.14。蛋白结构域预测发现NlATPSα 基因有一个 N-末端（位于 67-133 个氨基酸）和 C-末端（位于 420-545个氨基酸）结构域；NlATPSβ 基因有一个 N-末端（位于 60-126 个氨基酸）和C-末端（位于 408-518 个氨基酸），第 195-379 个氨基酸编码一个 AAA+ ATPase结构域，具体见图 2.3 的下划线。

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