小麦RING型E3泛素连接酶基因TaSDIR1克隆与功能分析

发布时间：2020-08-21 13:08

【摘要】：小麦(Triticum aestivum L.)是我国的三大主要粮食作物之一,在保障粮食安全中占有至关重要的作用。随着社会的飞速发展,全球气候日渐变暖,干旱、高温和盐渍等非生物胁迫严重影响着小麦生产。因此,挖掘利用抗逆相关基因资源,选育抗逆高产稳产小麦品种已成为提升逆境胁迫下小麦生产力的一种重要途径。E3泛素连接酶具有调控植物生长发育等功能,并参与植物逆境胁迫信号转导途径,与植物的抗逆性紧密相关。本研究以小麦品种旱选10号为材料,克隆了E3泛素连接酶基因TaSDIR1(SALT-AND DROUGHT-INDUCED REALLY INTERESTING NEW GENE FINGER1),通过基因的组织表达分析、在非生物逆境胁迫条件下的表达模式分析以及体外泛素化实验分析明确了TaSDIR1基因的功能;开发基因的分子标记,利用小麦DH群体进行遗传定位,利用小麦自然群体进行关联分析,了解基因单倍型与农艺性状之间的关系,发掘优异单倍型,为小麦育种提供基因资源和标记。主要研究结果如下:1.克隆了小麦A、D基因组中E3泛素连接酶基因TaSDIR1-A和TaSDIR1-D,由8个外显子和7个内含子构成;氨基酸序列一致性高达97.14%,包含2个跨膜结构域和1个相对保守的RING型finger结构域。2.TaSDIR1-A和TaSDIR1-D在小麦抽穗期各个组织中均有表达,其中在旗叶中的表达量最高;TaSDIR1-A和TaSDIR1-D均响应NaCl、ABA、PEG和4℃这4种非生物胁迫,表现出不同程度的上调表达趋势。其中对PEG模拟的干旱胁迫响应最强,对NaCl、ABA和4℃的响应相对较弱。3.体外泛素化实验分析证明TaSDIR1蛋白能结合泛素,具有E3泛素连接酶活性;RING结构域受破坏的TaSDIR1~(H244Y)蛋白不能与泛素结合,失去E3连接酶活性,证明了完整的RING型结构域是TaSDIR1蛋白E3泛素连接酶活性的重要保证。4.利用小麦A、B、D基因组供体种的不同倍性材料以及一套由中国春为背景的缺四体材料将TaSDIR1-A和TaSDIR1-D分别定位在小麦染色体4A和4D上。进一步利用小麦DH群体的150份材料将TaSDIR1-A定位在小麦染色体4A的标记AX-111451343和Xwmc89之间,遗传距离分别为1.60 cM和2.31cM。5.TaSDIR1-A序列全长3.2 kb。检测32份多态性较高的六倍体小麦材料的DNA序列,在非编码区发现1个SNP(A/G)和1个2 bp的InDel(CC/--),根据这两个多态性位点的连锁关系,开发dCAPS标记SNP-397,扫描小麦自然群体材料的基因型,将其分为Hap-4A-1和Hap-4A-2两种单倍型,关联分析结果显示两种单倍型分别与千粒重、株高、穗下节长和倒二节长显著相关,且Hap-4A-2为改良小麦农艺性状的优异单倍型。6.TaSDIR1-D序列全长4.07 kb,在全长序列中共检测到2个SNP,其中1个位于编码区上游序列-583 bp(T/C),另1个位于编码区603 bp(A/G),其中编码区的SNP位点位于第4外显子上,为非同义突变,造成氨基酸的改变,使精氨酸(CGC)改变成组氨酸(CAC)。根据这两个多态性位点的连锁关系,开发dCAPS标记SNP-583,扫描小麦自然群体材料的基因型,将其分为两种单倍型Hap-4D-1和Hap-4D-2,关联分析结果显示两种单倍型分别与千粒重、倒二节长和穗长显著相关,且Hap-4D-2为改良小麦农艺性状的优异单倍型。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S512.1
【图文】：

途径,泛素,蛋白质

白酶体途径酶体途径作为机体调节细胞内蛋白水平与功能的一个化的蛋白并将其降解[45]。在泛素蛋白酶体途径中，细多余的蛋白质进行降解，并且同时会消耗一部分能量化酶 E1、泛素结合酶 E2、泛素连接酶 E3、蛋白酶泛素蛋白酶体途径降解蛋白质包括泛素与蛋白底物的的降解两个阶段[47]。首先泛素活化酶 E1 通过消耗 A物，也就是泛素的活化；活化的泛素与 E2 结合后与物；接着 E3 会特异性识别并结合一些被修饰过的蛋合物与目标蛋白相连接，与此同时释放 E2，形成特定白酶体对底物的降解阶段，使泛素化的蛋白质被 26S或氨基酸[48](图 1.1)。

技术路线图,技术路线

第一章引言1.4 本研究的目的意义及技术路线小麦是我国的主要粮食，在保障粮食安全中占有至关重要的作用，小麦的生长发育、代谢过程及最终产量的形成与周围环境有着密不可分的关系。迄今为止，RING 型 E3 泛素连接酶在拟南芥[76]、玉米[77,78]和水稻[79,80]中已有比较深入的研究，而小麦基因组庞大[81,82]，对其研究较为困难，与之相关报道较少。本研究通过克隆小麦的 E3 泛素连接酶基因 TaSDIR1，分析基因结构和序列多态性，通过染色体及遗传定位分析、关联分析、小麦抽穗期组织特异性表达分析、不同非生物胁迫条件下基因的表达模式分析，以及体外泛素化分析等方法研究该基因的功能，开发分子标记，发掘优异单倍型，为小麦株型及产量改良提供理论依据和技术，同时也为抗逆育种提供基因资源。具体技术路线如图 1.2 所示：

氨基酸序列,物种,泛素,连接酶

第三章结果与分析第三章结果与分析3.1 TaSDIR1 功能研究3.1.1 TaSDIR1 序列比对分析参照拟南芥同源基因 AtSDIR1 (At3g55530)的氨基酸序列，在 URGI 数据库中进行比对分析，在小麦 A 和 D 基因组中分别获得一个与其同源性较高的基因序列，分别命名为 TaSDIR1-A 和 TaSDIR1-D。TaSDIR1-A 编码 280 个氨基酸序列，TaSDIR1-D 编码 282 个氨基酸序列，通过 DNAMAN 软件比对这两个同源基因的氨基酸序列，TaSDIR1-A 和 TaSDIR1-D 编码的氨基酸序列一致性高达 97.14%。与拟南芥、水稻、玉米和烟草等其他物种相比，都具有两个跨膜结构域和一个相对保守的 RING 结构域(图 3.1A)。

【参考文献】