菜豆环氧化物水解酶基因的克

发布时间：2020-08-22 01:42

【摘要】：手性环氧化物和邻二醇是合成手性化合物的重要中间体,在功能材料、医药和农药等的合成中有着重要的应用价值。环氧化物水解酶(epoxide hydrolases,EHs)能催化外消旋环氧化物的选择性开环生成相应的手性邻二醇或选择性保留手性环氧化物。区域选择性高且互补的单一EH催化外消旋环氧化物对映归一性水解是制备手性邻二醇的理想途径,但目前仅有少数EHs具有此特性。本论文从菜豆(Phaseolus vulgaris)基因组中扩增了一种编码PvEH3的基因pveh3,并将其在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功实现异源表达;采用定点和迭代突变技术对PvEH3进行分子改造,以获得高活力和高区域选择性的PvEH3突变体;通过构建双相催化体系解除底物对最优突变体PvEH3~(G170E/F187L/P237L)的抑制作用。以菜豆总RNA为模板,采用逆转录PCR和巢式PCR技术扩增了一条新型环氧化物水解酶的编码基因pveh3,其长度为957 bp,编码318个氨基酸。一级和三维结构分析表明PvEH3属于α/β水解酶超家族,其催化三联体为D101-H297-D262,两个保守质子供体为Y150和Y232。SDS-PAGE结果显示PvEH3的表观分子量为36.1 kDa,催化特性研究表明PvEH3能催化对氯环氧苯乙烷(pCSO)的对映归一性水解,产物(R)-对氯苯乙二醇(pCPED)的对映体过量值(ee_p)为85.1%。PvEH3对(S)-和(R)-pCSO的区域选择性系数α_S和β_R分别为87.0%和98.0%。通过镍离子亲和层析柱对目的蛋白进行纯化,PvEH3的比活力为1.36 U·mg~(-1),针对pCSO的动力学参数K_m和k_(cat)/K_m分别为6.60mM和0.583 mM~(-1)·s~(-1)。基于PvEH3与(R)-pCSO的分子对接模拟分析和与植物EHs的氨基酸序列比对结果对PvEH3的7个非保守氨基酸位点进行定点突变。其中突变体PvEH3~(G170E)全细胞比活力最高为12.86 U·g~(-1) wcw,是PvEH3的3.7倍;PvEH3~(F187L)和PvEH3~(P237L)对映归一性最好,ee_p分别从PvEH3的85.1%提高至90.0%和91.2%。随后经组合点突变和迭代饱和突变获得最优突变体PvEH3~(G170E/F187L/P237L),其全细胞比活力从3.45提高至20.31 U·g~(-1)wcw,区域选择性系数α_S和β_R分别为95.0%和98.0%。纯化后PvEH3~(G170E/F187L/P237L)催化pCSO的K_m和k_(cat)/K_m分别为4.86 mM和1.81 mM~(-1)·s~(-1)。在环己烷的体积比为5%、全细胞催化剂与底物的重量比为12:1(w/w)的双相催化体系中,PvEH3~(G170E/F187L/P237L)全细胞催化200 mM pCSO对映归一性水解5.5 h后,产物(R)-pCPED的ee_p和产率分别为96.1%和98.0%,时空产率STY为6.16 g·L~(-1)·h~(-1)。底物谱分析表明,PvEH3能催化环氧苯乙烷(SO)及其4种衍生物的水解,取代基的类型和位置均影响其活力和对映归一性,PvEH3~(G170E/F187L/P237L)对5种底物的催化活力较PvEH3均有提高,是PvEH3的2.1~5.9倍。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2
【图文】：

外消旋,环氧化物,类型,对映体

第一章绪论1.1 环氧化物水解酶环氧化物水解酶 (epoxide hydrolases, EHs, EC 3.3.2-) 能催化外消旋环氧化物的择性开环，通过加成一个水分子生成相应的手性邻二醇或选择性保留手性环氧化物[1]EHs 催化外消旋环氧化物水解主要有水解动力学拆分和对映归一性水解两种形式。EH水解动力学拆分外消旋环氧化物时优先催化其中一种对映体水解从而保留另一种对体，理论产率为 50% (图 1-1 (a))。对映选择性的高低用对映选择率 (enantiomeric ratio, 来评价，E 值越高对映选择性越好，保留的对映体的纯度用底物对映体过量值(enantiomeric exess, ees) 表示[2]。EHs 对映归一性水解外消旋环氧化物时对两种对映体有互补的区域选择性，即攻击一种对映体的 β-碳原子而攻击另一种对映体的 α-碳原子从而得到理论产率为 100%的手性邻二醇，其纯度用 eep表示，eep越高说明该酶催化底物的对映归一性越好 (图 1-1 (b))[3]。

拓扑结构图,三维结构,代表性,拓扑结构

两大结构域分别为核心结构域和盖子结构域：核心结构域由 α 螺旋和 β 折叠组成，包括一段 core loop 和催化三联体；盖子结构域位于核心结构域上方，主要由 α 螺旋组成，包括一段 cap loop 和两个保守质子供体[9,10]；NC loop 起着连接两大结构域的功能[11]。A.niger EH 也属于 α/β 水解酶超家族，其不对称晶胞为两个 44 kDa 的亚基，每一个亚基又可以分为 3 个部分，α/β 核心结构域、盖子结构域和 N-末端锚定结构域 (N-termmalmeander)[12]。α/β 核心结构域包括包括催化三联体 D192-H374-D348，盖子结构域包括 6个覆盖在催化三联体上方的 α 螺旋 (图 1-2 (b))。(2) 来源于人类的 LTA4H 属于白三烯A4水解酶，三维结构如图 1-2 (c) 所示，由 N 端结构域、催化结构域和 C 端结构域 3 部分组成[13]。其 N 段结构域由 7 个 β 折叠股和 2 个 β 折叠片 (4 个 β 折叠股) 组成，催化结构域位于N端结构域下方由α螺旋叶和α螺旋/β折叠混合叶组成，无规则卷曲Pro-richloop 连接催化结构域和 C 端结构域。(3) 红串红球菌 (R. erythropolis) EH 属于柠檬烯-1,2-EHs，是典型非 α/β 水解酶超家族的 EH (图 1-2 (d))，每个亚基由 6 个 β 折叠片和 α螺旋组成，且 β 折叠片彼此垂直[14]。催化三联体 D101-R99-D132 位于由 β 折叠片和 3个 N 末端 α 螺旋组成的口袋中。

水解酶,环氧,芳香剂,角质素

图 1-3 α/β 水解酶超家族 EHs 催化机制Fig. 1-3 Catalytic mechanism of α/β-fold superfamily EHs白三烯 A4水解酶的催化机理是 Zn2+作为 Lwies 介导与 His 和 Glu 结合催化环开环反应[11, 17]。柠檬烯 1,2-EHs 在催化过程中不形成乙二醇-单酯-酶中间体复直接通过一步反应来催化底物开环：Asp 在 Asn 和 Tyr 的辅助下激活水分子，分子直接亲核攻击环氧环中的一个碳原子，与此同时，Asp 通过给环氧环的氧质子来将其激活，因此，邻二醇通过推挽式的方式一步获得。产物释放以后， Arg 的协助下将质子传递给另外一个 Asp，使酶恢复最初始状态。3 EHs 基因的挖掘1963 年 Hartmann 和 Tulloch 在锈菌的孢子中发现可以水解顺式和苏式-9,10-环的 EH[12, 19]。1980~1982 年，科研工作者陆续在真菌和细菌中发现了能水解各环氧化物的 EHs，从此对环氧化物水解酶底物特异性和立体选择性的研究得到展[20, 21]。植物来源的 EHs 在角质素、芳香剂和抗真菌化合物的合成中起着重[22]。Stapleton 等在土豆 (Solanum tuberosum) 中克隆和表达了一种可溶性的 St

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