抗草甘膦和提高磷吸收的双价基因载体构建及对甘蓝型油菜的遗传转化研究
发布时间：2020-08-22 05:45
【摘要】：甘蓝型油菜从植物分类学上属十字花科芸薹属(Brassica),是我国极其重要的油料、饲用作物。随着社会化进程不断加深和经济的飞速增长,人们对植物油需求量急剧增加,这对甘蓝型油菜生产提出了新的挑战。由于其生长过程中常常受到有效磷匮乏及草害影响,大大限制了它的发展。因此,为获得高效磷素吸收利用同时兼具草甘膦抗性的甘蓝型油菜新种质,本研究构建了含有油菜叶绿体导肽eCTP、草甘膦抗性基因EPSPS、根部特异性启动子Pht1;2和植酸酶基因phyA的植物重组表达载体pC-NLTA。并采用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜‘陇上东’、‘1831R’和‘新疆21109’三个品种,对于确定转基因甘蓝型油菜磷素吸收及草甘膦抗性具有一定的理论研究意义,同时也为获得磷素高效吸收利用兼具草甘膦抗性的新型油菜种质资源提供研究的理论依据和参考。本试验主要研究结果如下:1.运用生物信息学软件:TargetP 1.1 Server和ChloroP 1.1 Server预测了油菜rbcS的亚细胞定位,同时也得到了其编码氨基酸序列中的转运肽和剪切位点,分析整理得到了理想的转运肽序列并命名为eCTP;2.以质粒pMD-nos为模板亚克隆得到nos终止子,以甘蓝型油菜RG2 cDNA为模板克隆得到叶绿体转运肽eCTP,以质粒pTOPO-EPSPS为模板亚克隆得到EPSPS基因,以提取的野生型拟南芥的DNA为模板克隆得到根特异性启动子Pht1;2,以质粒PGA1611-E-PhpAO为模板亚克隆得到phyA基因,采用重叠PCR方法将叶绿体转运肽eCTP与EPSPS基因融合,得到了融合片段L;3.以pCEPSP为基础载体,采用酶切连接的方法,依次插入nos终止子、融合片段L、根特异性启动子Pht1;2及植酸酶基因phyA,最终构建获得了植物重组表达载体pC-NLTA,并利用冻融转化法将其整合到了农杆菌LBA4404中;4.采用农杆菌介导法转化三个品种甘蓝型油菜(‘新疆21109’、‘1831R’和‘陇上东’),经过草甘膦抗性筛选和PCR扩增检测,分别得到2株‘新疆21109’阳性转基因植株、2株‘1831R’阳性转基因植株和1株‘陇上东’阳性转基因植株;5.利用qRT-PCR技术对T0代阳性植株内各基因的表达进行检测,结果表明,与对照植株相比,阳性植株内植酸酶基因phyA和草甘膦抗性基因EPSPS的表达量均得到显著提高。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S565.4
【图文】：
甘肃农业大学 2018 届硕士学位论文的克隆的亚克隆含 nos 终止子）质粒为模板，用 N1/N（图 4A），回收目的基因并与 pMD19提取重组质粒，并用 Hind Ⅲ和 PstⅠ双图 4B），将酶切结果合适的重组载体测序结果表明，与 GenBank 中注册的说明已经成功亚克隆到 nos 终止子。
因的亚克隆PS（含 CP4 EPSPS）质粒为模板，用 E1/E2带（图 6A），回收目的基因并与 pMD1中。提取重组质粒，用 EcoRⅠ和 XhoⅠ双适（图 6B），将酶切结果合适的重组载体命。测序结果表明，与 GenBank 中注册的完全一致（见附表 1.3），说明已经成功亚克A BTP 的 PCR 产物及重组子 pMD-eCTP 的酶切产物电泳结ication of eCTPand restrict digestion analysis of recombipMD-eCTPA-1、2、3 eCTP的PCR产物；B-1、2 pMD-eCTP经KpnⅠ和 XhoⅠ双r；A-1,2,3 PCR product of eCTP; B-1,2 pMD-eCTP was digested by Kpn
基因的亚克隆-EPSPS（含 CP4 EPSPS）质粒为模板，用 E1/E的条带（图 6A），回收目的基因并与 pMD细胞中。提取重组质粒，用 EcoRⅠ和 XhoⅠ小合适（图 6B），将酶切结果合适的重组载体序。测序结果表明，与 GenBank 中注册的列完全一致（见附表 1.3），说明已经成功亚A B 5 eCTP 的 PCR 产物及重组子 pMD-eCTP 的酶切产物电泳mplification of eCTPand restrict digestion analysis of recombpMD-eCTParker；A-1、2、3 eCTP的PCR产物；B-1、2 pMD-eCTP经KpnⅠ和 XhoⅠMarker；A-1,2,3 PCR product of eCTP; B-1,2 pMD-eCTP was digested by K
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S565.4
【图文】：
甘肃农业大学 2018 届硕士学位论文的克隆的亚克隆含 nos 终止子）质粒为模板，用 N1/N（图 4A），回收目的基因并与 pMD19提取重组质粒，并用 Hind Ⅲ和 PstⅠ双图 4B），将酶切结果合适的重组载体测序结果表明，与 GenBank 中注册的说明已经成功亚克隆到 nos 终止子。
因的亚克隆PS（含 CP4 EPSPS）质粒为模板，用 E1/E2带（图 6A），回收目的基因并与 pMD1中。提取重组质粒，用 EcoRⅠ和 XhoⅠ双适（图 6B），将酶切结果合适的重组载体命。测序结果表明，与 GenBank 中注册的完全一致（见附表 1.3），说明已经成功亚克A BTP 的 PCR 产物及重组子 pMD-eCTP 的酶切产物电泳结ication of eCTPand restrict digestion analysis of recombipMD-eCTPA-1、2、3 eCTP的PCR产物；B-1、2 pMD-eCTP经KpnⅠ和 XhoⅠ双r；A-1,2,3 PCR product of eCTP; B-1,2 pMD-eCTP was digested by Kpn
基因的亚克隆-EPSPS（含 CP4 EPSPS）质粒为模板，用 E1/E的条带（图 6A），回收目的基因并与 pMD细胞中。提取重组质粒，用 EcoRⅠ和 XhoⅠ小合适（图 6B），将酶切结果合适的重组载体序。测序结果表明，与 GenBank 中注册的列完全一致（见附表 1.3），说明已经成功亚A B 5 eCTP 的 PCR 产物及重组子 pMD-eCTP 的酶切产物电泳mplification of eCTPand restrict digestion analysis of recombpMD-eCTParker；A-1、2、3 eCTP的PCR产物；B-1、2 pMD-eCTP经KpnⅠ和 XhoⅠMarker；A-1,2,3 PCR product of eCTP; B-1,2 pMD-eCTP was digested by K
【参考文献】
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本文编号：2800337
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