哈维弧菌T6SS中rbsB、vgrG、hcp基因的表达及功能分析

发布时间：2020-08-24 20:38

【摘要】：哈维弧菌(Vibrio harveyi)作为海水养殖业重要的致病菌,可感染多种鱼、虾、蟹等并造成大量的死亡,在水产养殖中受到高度重视。Ⅵ型分泌系统(T6SS)主要存在于革兰氏阴性细菌中,具有增强生物膜形成的特性及识别非己的功能,并参与了细菌间的相互作用,表现出复杂多样的生物学功能。为了研究哈维弧菌的T6SS,本研究选择T6SS中针尖状结构的缬氨酸-甘氨酸重复蛋白(VgrG)、T6SS负责运输效应因子并作为分子伴侣的溶血素协同调节蛋白(Hcp)、依靠T6SS分泌的核糖体结合蛋白(RbsB)作为主要研究对象,分析其序列特征及其进化关系,制备原核表达重组蛋白及其多克隆抗体,建立qPCR技术;利用已建立的qPCR技术研究不同培养条件对三者表达的影响;最后通过敲除vgrG、rbsB、hcp及其相关的基因,研究三者同其调控基因在T6SS,以及T6SS在整个细菌致病机制中发挥的作用。主要结果如下:1、rbsB、vgrG、hcp基因分别包含879 bp、1836bp、480bp DNA序列长度,可分别编码292aa、611aa、159aa。RbsB蛋白为可分泌的周质蛋白,在运载结合中发挥作用;VgrG蛋白与T4噬菌体gp27/gp5组件同源,帮助细菌锚定宿主细胞分泌效应因子;Hcp蛋白与T4噬菌体gp19/gp5同源,可形成六聚体通道,以供小分子蛋白分泌及自身转运。从rbsB、hcp到vgrG基因,三者的属间变异率逐渐升高,在哈维弧菌类的相似率分别为97-100%、99-100%和70-99%,在弧菌属内的相似率分别在90%、84%和40%以上,这同它们的生物学功能特点一致。2、研究了哈维弧菌菌株354在不同培养条件(温度、盐度、pH、铜离子、铁离子)下培养4、8、12、24、48h后rbsB、vgrG、hcp mRNA表达情况。结果发现:rbsB mRNA,在28℃、1%NaCl、pH7.5、无Fe~(3+)、无Cu~(2+)培养条件下,随时间呈凹型表达模式,即在生长对数期为典型洼地。仅提高培养温度,其中后期表达量明显提高;改变盐度,在早期呈现高盐诱导效应;调节pH,则无论偏酸或者偏碱,俱提高其中后期表达;添加Fe~(3+),可见高浓度Fe~(3+)抑制早期的rbsB表达;添加Cu~(2+),则无明显诱导效应。vgrG mRNA,在高温培养条件下,其表达受到抑制;低渗(0.5%)明显诱导基因在整个培养过程中的高表达,高渗影响不显著,都呈凹表达模式;在偏酸或偏碱条件下,早期对于其表达无影响,中后期诱导表达量的上升;对于添加Fe~(3+)实验组而言,高浓度铁离子显著诱导vgrG高表达;适当浓度的铜离子(1mM、2mM)可刺激vgrG的表达,在培养中后期其表达量明显升高,而高浓度铜离子则在一定程度上抑制vgrG的表达。hcp在仅提高培养温度的情况下,其mRNA的表达与呈现凹型表达的对照组无明显差别,在培养后期其表达量呈现降低的趋势;改变盐度,添加3%NaCl在细菌生长对数期可刺激hcp的表达,继续提高盐度,其表达水平在细菌培养前期受到抑制,后期表达量才有明显提高;无论偏酸或偏碱,均提高hcp在细菌生长后期的表达水平;添加铁离子,可一定程度上促进hcp的表达;而铜离子可显著刺激细菌培养中后期hcp的表达量(P0.05)。3、为进一步探究vgrG与hcp、rbsB基因在T6SS中的功能,以及T6SS在哈维弧菌中的功能,成功构建rbsB、luxp、luxO、vgrG、vasC哈维弧菌缺失株,对hcp表达量差异、生物膜形成能力、运动性、以及共培养条件下对外源菌拮抗性进行探究。结果表明与野生株相比,各敲除株hcp表达量都有不同程度的提高,说明该hcp在T6SS中存在负调控功能;在细菌运动能力方面,ΔrbsB与Δluxp菌株在软琼脂平板上的扩散能力要强于野生株及其余几株突变菌;在生物膜形成能力上,各缺失株均弱于野生株,说明生物膜的形成需要T6SS的参与;在与大肠杆菌共培养的拮抗实验中,与对照组相比,哈维弧菌野生株与突变株都表现出了不同程度对大肠杆菌的拮抗能力,然而vasC突变株却并不体现该特点。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S941.4
【图文】：

示意图,作用机制,示意图

4）供能组分：ClpV。ClpV 通过 ATP 酶的水解作用供能，能使分泌蛋白过程，从而在膜融合、蛋白修复和降解等过程中发挥重要作用[76]。5）膜联蛋白 IcmF：IcmF 是具 ATP 酶活性的结构蛋白，具有三个跨膜螺参与 Hcp 管道的形成与跨膜转运，且细菌 IcmF 缺失株在培养过程中无法检测到 Hcp 蛋白[77]。作用机制先基底复合物与 Hcp 管同时形成，基底复合物可能由 gp25，VgrG 和其蛋白质构成，共同跨越内外膜与肽聚糖；第二步是外鞘的聚合，VipA/VipB绕 Hcp 管拼装，装配好的组件形成一个“注射器”的结构。基底复合物上，导致 VgrG / Hcp 管穿透效应细胞膜向邻近靶细胞膜分泌，其他分泌蛋用 Hcp 管作为管道分泌至靶细胞或胞外环境；最后，收缩鞘分离且被 Ce 分解，游离的 VipA/B 二聚体再参与新的 T6SS 装配过程。当不锚定相应，Hcp 和 VgrG 可作为分泌蛋白释放到胞外。

示意图,哈维,弧菌,示意图

分泌蛋白参与弧菌毒力调控并影响毒力强弱；除参与菌间竞争外，T6SS 可帮助细菌适应环境，那是否同时参与菌间互利共生也是未知的。实验室前期对哈维弧菌354进行基因组测序后发现该菌存在两套T6SS，分别位于两条染色体上（如图1-2），两套 T6SS 究竟如何行使功能仍有待探究。因此本研究对位于第二条染色体上编码T6SS 的两个重要结构蛋白 Hcp、VgrG，与分泌蛋白 RbsB 的基因进行克隆，研究哈维弧菌在不同培养条件，如温度、盐度、pH 等环境因子胁迫下 3 种基因表达量的变化，同时构建 T6SS 相关基因缺失株，探究哈维弧菌 T6SS 功能及作用机制，为哈维弧菌的防控与治疗提供理论基础。图 1-2 哈维弧菌 354 T6SS ?

弧菌,系统进化树,氨基酸序列,哈维

Tab. 2-4 Homology analysis of amino acids of RbsB from V. harveyi 354 strain and othbacterial species菌种 Species同源性%Homology注册号Accession N.o哈维弧菌（V. harveyi ATCC 33843） 100 % AIV07307.1欧文弧菌（V. owensii CAIM 1854） 100 % KIF46393.1氏弧菌（V. campbellii ATCC BAA-1116） 98 % AGU97393.1轮虫弧菌（V. rotiferianus HM-10） 98 % OHY94262.1藻弧菌（V. alginolyticus ATCC 17749） 97 % GAD69766.1血弧菌（V. parahaemolyticus ATCC 17802） 97 % KKI09273.1需钠弧菌（V. natriegens ATCC 14048） 97 % EPM40141.1贻贝弧菌（V. mytili CAIM 528） 96 % KIN10841.1创伤弧菌（V. vulnificus ATCC 33147） 92 % KGK71697.1远青弧菌（V. azureus NBRC 104587） 92 % GAD74752.1

【参考文献】