异源表达谢瓦散囊菌谷氨酸脱氢酶基因EcGDH对水稻抗旱性的影响
发布时间：2020-08-25 01:55
【摘要】：干旱胁迫是危害重要粮食作物水稻(Oryza sativa)正常生长,影响产量的逆境之一。植物受到干旱逆境胁迫时,会导致体内NH4+的积累,过量NH4+对细胞有毒害作用。在植物中NH4+同化途径有两条,即谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)/谷氨酸合成酶(glutamate synthase,GOGAT)途径和谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase,GDH)途径。然而,植物体内的GDH对NH4+的亲和能力较低,使GDH对NH4+的同化作用不能有效的进行。因此,提高植物中GDH对NH4+的同化能力,降低干旱胁迫引起细胞内高浓度的NH4+的毒害作用,是抵抗干旱胁迫的有效途径。基于以往的研究,对EcGDH,一个从真菌谢瓦散囊菌(Eurotium chevalier)中克隆得到GDH基因,并将其转入水稻(Oyza sativa cv.Kitaake)中过表达,并对其影响水稻耐旱机理进行相关研究。1.通过原核表达重组蛋白,对纯化之后的EcGDH蛋白进行体外酶活的测定,也分析了转基因株系体内的GDH酶活。发现His-TF-EcGDH在体外氨化酶活高于脱氨化酶活性,NADP(H)-GDH在转基因株系中的酶活显著高于野生型,且氨化的酶活性也显然要比去氨化酶活性高。2.分析转基因株系Ubi::EcGDH-12和Ubi::EcGDH-13在正常和模拟干旱胁迫下的表型,并观察叶片气孔形态,在模拟干旱胁迫处理条件下,过表达EcGDH转基因株系的抗干旱能力明显高于野生型植株,转基因株系的全开气孔的比例显著低于野生型。3.测定了正常和模拟干旱下NH4+、谷氨酸、脯氨酸及可溶性糖的含量,通过定量PCR分析了EcGDH基因对脯氨酸运输和水稻逆境响应相关基因在正常条件下和在脱水处理条件下mRNA表达水平的影响。在模拟干旱处理下,转基因株系与野生型株系相比,NH4+含量要低,而谷氨酸、脯氨酸以及可溶性糖的含量显著高于野生型。qR-PCR结果显示,在模拟干旱处理下,转基因株系中与脯氨酸转运有关以及干旱诱导表达的基因的表达量也明显高于野生型。4.由于干旱胁迫总伴随着氧化损伤,为了验证EcGDH基因的过表达是否能提高水稻的抗氧化能力,分析了 CAT、POD、SOD和MDA一系列氧化相关指标。研究结果显示,转基因株系中的CAT、POD、SOD在模拟干旱条件下含量高于野生型,MDA的含量处理条件下则低于野生型。由此表明,水稻中异源表达谢瓦散囊菌EcGDH能够通过提高GDH酶活,将由胁迫引起的过量积累的NH4+生成谷氨酸,降低高NH4+引起的细胞毒害,从而提高EcGDH过表达株系水稻对干旱的耐受性,为寻找抗旱新品种水稻奠定理论基础。
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511
【图文】：
增强［５５－５火在苜蓿和小麦中转入微生物的毋仇４基因，能明显提高它们的除草剂抗逡逑性，说明ＧＤＨ与植物抗逆的能力相关网。ＧＤＨ能够将２－ＯＧ和ＮＨ４＋同化生产谷逡逑氨酸，因此在植物碳和氮的代谢循环中具有重要意义，其体的生理作用仍然很大逡逑探索空间［６１－６３］。ＧＤＨ可以分解碳源，可以在碳含量缺乏的时候为三羧酸循环提供逡逑碳骨架，来维持植物细胞内碳氮的平衡［６４？？。细胞内氨的积累受外界氨的含量影逡逑响，也可能源于衰老诱导的蛋白质水解或者非生物胁迫，并能因此而提高ＧＤＨ逡逑的氨化活性［６９＿７５］。在长于植物茎底部、发育完全和生理代谢活跃的叶子中，逡逑ＧＯＧＡＴ的表达量很高，且它有大的蛋白质积累量和很强的蛋白活性，而ＧＤＨ的逡逑量和活性则很低。但在植物生长发育的后期，随着ｇ＜＾－ＮＡＤ基因的表达，ＧＤＨ逡逑蛋白会随之积累并且氨化酶活性也会增加，而ＧＳ和ＧＯＧＡＴ在衰老的叶片中会逐逡逑渐减少逡逑１．３．２邋ＧＤＨ与植物干旱逆境逡逑ＧＤＨ与脯氨酸的合成有着紧密的关联。当植物处于干旱胁迫下时能进行自我逡逑调节，对细胞膨压进行维持，防止脱水死亡，称为渗透调节（Ｏｓｍｏｔｉｃ邋Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ，逡逑
工程硕士学位论文逡逑量移液器：德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司；恒温培养摇床：苏坤公司；ＣＨ公司；超声波细胞破碎仪：宁波新芝公司；ＵＶＰ成像凝；紫外分光光度计：购于Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司；逡逑体及载体逡逑：ｃｏ／0大肠杆菌ＤＨ５ａ和五．ｃｏ／／邋ＢＬ２１（ＤＥ３）是本实：大肠杆菌原核表达载体ｐＣｏｌｄ－ＴＦ为本实验室之前所保存。逡逑－ｃｓｐＡ邋３＇ＵＴＲ逡逑—
用ＨＲＰ标记过的Ｈｉｓ抗体，进行Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ印迹结逡逑果表明，纯化后的两种蛋白在相对分子量大约为１１０邋ｋＤ处，出现了特异性条带（见逡逑图２．３邋Ｂ），和预期结果一致。因此，证实获得的原核重组融合蛋白就是所需要目逡逑的蛋白。逡逑２．２．３五ｃＧＤＨ的体外酶活分析逡逑为判断体外的表达五ｃＧＤＨ蛋白是否ＧＤＨ酶活性，本实验对纯化之后的目逡逑的蛋白五ｃＧＤＨ进行酶活分析。测量ＧＤＨ催化的还原氨基化反应体系内ＮＡＤＰＨ逡逑Ａ逦／逦＾邋Ｂ逦了邋Ｚ逡逑ＫＤａ邋Ｚ邋命’逦ＫＤａ逡逑ｉｏ0邋灥逦ｉ00逦Ｗ逡逑７０逦~專哄义稀！*、ｉ逦７０逡逑５５}瑁撸摺掊危担靛义贤迹玻冲澹穑茫铮欤洌裕疲澹悖牵模仍吮泶锏鞍椎模樱模樱校粒牵藕停祝澹螅簦澹颍铄澹猓欤铮舴治鲥义希粒捍炕模龋椋螅裕瓶赵乇昵┑鞍缀停龋椋螅裕疲牛悖牵模鹊鞍祝唬洛澹哄澹龋椋螅裕瓶赵乇昵┑鞍缀湾义希龋椋螅裕疲澹悖牵模儒宓鞍椎腻澹祝澹螅簦澹颍铄澹猓欤铮翦寮觳狻ｅ义希玻板义
本文编号：2803113
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511
【图文】：
增强［５５－５火在苜蓿和小麦中转入微生物的毋仇４基因，能明显提高它们的除草剂抗逡逑性，说明ＧＤＨ与植物抗逆的能力相关网。ＧＤＨ能够将２－ＯＧ和ＮＨ４＋同化生产谷逡逑氨酸，因此在植物碳和氮的代谢循环中具有重要意义，其体的生理作用仍然很大逡逑探索空间［６１－６３］。ＧＤＨ可以分解碳源，可以在碳含量缺乏的时候为三羧酸循环提供逡逑碳骨架，来维持植物细胞内碳氮的平衡［６４？？。细胞内氨的积累受外界氨的含量影逡逑响，也可能源于衰老诱导的蛋白质水解或者非生物胁迫，并能因此而提高ＧＤＨ逡逑的氨化活性［６９＿７５］。在长于植物茎底部、发育完全和生理代谢活跃的叶子中，逡逑ＧＯＧＡＴ的表达量很高，且它有大的蛋白质积累量和很强的蛋白活性，而ＧＤＨ的逡逑量和活性则很低。但在植物生长发育的后期，随着ｇ＜＾－ＮＡＤ基因的表达，ＧＤＨ逡逑蛋白会随之积累并且氨化酶活性也会增加，而ＧＳ和ＧＯＧＡＴ在衰老的叶片中会逐逡逑渐减少逡逑１．３．２邋ＧＤＨ与植物干旱逆境逡逑ＧＤＨ与脯氨酸的合成有着紧密的关联。当植物处于干旱胁迫下时能进行自我逡逑调节，对细胞膨压进行维持，防止脱水死亡，称为渗透调节（Ｏｓｍｏｔｉｃ邋Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ，逡逑
工程硕士学位论文逡逑量移液器：德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司；恒温培养摇床：苏坤公司；ＣＨ公司；超声波细胞破碎仪：宁波新芝公司；ＵＶＰ成像凝；紫外分光光度计：购于Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司；逡逑体及载体逡逑：ｃｏ／0大肠杆菌ＤＨ５ａ和五．ｃｏ／／邋ＢＬ２１（ＤＥ３）是本实：大肠杆菌原核表达载体ｐＣｏｌｄ－ＴＦ为本实验室之前所保存。逡逑－ｃｓｐＡ邋３＇ＵＴＲ逡逑—
用ＨＲＰ标记过的Ｈｉｓ抗体，进行Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ印迹结逡逑果表明，纯化后的两种蛋白在相对分子量大约为１１０邋ｋＤ处，出现了特异性条带（见逡逑图２．３邋Ｂ），和预期结果一致。因此，证实获得的原核重组融合蛋白就是所需要目逡逑的蛋白。逡逑２．２．３五ｃＧＤＨ的体外酶活分析逡逑为判断体外的表达五ｃＧＤＨ蛋白是否ＧＤＨ酶活性，本实验对纯化之后的目逡逑的蛋白五ｃＧＤＨ进行酶活分析。测量ＧＤＨ催化的还原氨基化反应体系内ＮＡＤＰＨ逡逑Ａ逦／逦＾邋Ｂ逦了邋Ｚ逡逑ＫＤａ邋Ｚ邋命’逦ＫＤａ逡逑ｉｏ0邋灥逦ｉ00逦Ｗ逡逑７０逦~專哄义稀！*、ｉ逦７０逡逑５５}瑁撸摺掊危担靛义贤迹玻冲澹穑茫铮欤洌裕疲澹悖牵模仍吮泶锏鞍椎模樱模樱校粒牵藕停祝澹螅簦澹颍铄澹猓欤铮舴治鲥义希粒捍炕模龋椋螅裕瓶赵乇昵┑鞍缀停龋椋螅裕疲牛悖牵模鹊鞍祝唬洛澹哄澹龋椋螅裕瓶赵乇昵┑鞍缀湾义希龋椋螅裕疲澹悖牵模儒宓鞍椎腻澹祝澹螅簦澹颍铄澹猓欤铮翦寮觳狻ｅ义希玻板义
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