沉默ATAD2基因增强人肝癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性体外实验研究

发布时间：2020-08-29 09:16

　　目的:肝癌是一种恶性程度较高,治愈率低的临床常见的恶性肿瘤,居全球恶性肿瘤发病率的第四位,病死率的第三位。目前采用包括如手术、放疗、化疗、分子靶向疗法、肝动脉化疗栓塞以及中医治疗等手段治疗肝癌,其中化疗仍是治疗中晚期肝癌的重要手段。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是晚期肝癌化疗的主要药物,但临床疗效仍不乐观,其失败的主要原因在于肝癌获得性耐药性的产生。因此,深入研究5-FU在肝癌细胞中的耐药机制具有重要临床意义。近年来,随着基因重组技术与分子生物学理论的成熟,有关肝癌耐药基因的研究不断涌现,这其中化疗联合基因治疗突现出广阔的应用前景。相关研究报道ATAD2基因与5-FU的化疗效果密切相关,而ATAD2基因是一种与肿瘤密切相关的原癌基因,位于染色体8q24.13其表达产物ATAD2又称ANCCA,在低分化组织或恶性肿瘤组织中高表达,而在分化成熟组织中低表达或不表达。本研究通过利用crispr/cas9基因敲除技术将ATAD2基因敲除,进而观察肝癌细胞对5-FU的敏感性变化并初步探讨其机制作用。研究方法:本研究选用肝癌Huh7细胞和HCCLM3细胞作为研究对象,通过crispr/cas9基因敲除技术将ATAD2基因敲除,建立ATAD2基因沉默的单克隆细胞系即Huh7-sh-ATAD2与HCCLM3-sh-ATAD2。Western blot的方法检测Huh7-sh-ATAD2细胞和HCCLM3-sh-ATAD2细胞ATAD2的蛋白表达情况。利用CCK-8实验检测不同浓度5-FU在48h和72h作用下对Huh7-sh-ATAD2及HCCLM3-sh-ATAD2细胞及其阴性对照细胞增殖抑制作用的差异和特征规律,并绘制相应的作用曲线。通过流式细胞仪检测5-FU处理后的细胞进行周期和凋亡的检测。通过Western blot的方法检测5-FU处理的癌细胞和未处理的癌细胞中GLi1的蛋白表达情况。结果:1经Western blot技术检测显示:敲除ATAD2基因的肝癌Huh7细胞和HCCLM3细胞,ATAD2蛋白不表达,ATAD2基因沉默稳定细胞系成建立成功。2 CCK-8增殖实验表明:1)5-FU作用于Huh7-sh-ATAD2细胞,HCCLM3-sh-ATAD2细胞,Huh-NC细胞以及HCCLM3-NC细胞,随着药物浓度的增加及作用时间的延长,各组细胞增值抑制率逐渐增高。差距具有统计学意义(p0.05)。2)给予5-FU处理,在相同作用浓度及作用时间下,Huh7-sh-ATAD2细胞与Huh-NC,HCCLM3-sh-ATAD2细胞与HCCLM3-NC相比,细胞增殖抑制率显著增高,差距具有统计学意义(p0.05)。3 Annexin V检测细胞凋亡,结果显示:加入5-FU处理后,HCCLM3、Huh-7细胞干扰组的细胞凋亡率均明显高于对照组,差别有统计学意义(P0.05),提示沉默ATAD2能够增强5-FU对HCCLM3、Huh-7细胞的细胞毒性作用。4 PI检测,加入5-FU处理,干扰组与对照组比较,HCCLM3、Huh-7细胞易阻滞于S期。5经Western blot技术检测显示,加入5-FU处理后,基因敲除组的Gli1蛋白表达明显低于对照组。初步证实ATAD2基因敲除后,5-FU的药敏性增加可能通过Hedgehog信号通路调控结论:1敲除ATAD2基因后,增加了肝癌细胞Huh7和HCCLM3对5-FU的敏感性。2敲除ATAD2基因后,肝癌细胞对5-FU敏感性增加的机制可能通Hedgehog信号通路调控
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：

基因敲除,蛋白表达,灰度值,转染

中国医科大学硕士学位论文3 结果3.1 Western blot 检测 ATAD2 基因敲除效果运用 crispr/cas9 技术敲除人肝癌细胞 Huh7 和 HCCLM3 的 ATAD2。结果显示转染后的细胞较未转染的细胞 ATAD2 的蛋白表达水平明显下降，差异有统计学意义（p＜0.05）。表 3.1ATAD2 基因敲除前后灰度值结果Huh7 Huh7-sh-ATAD2 HCCLM3 HCCLM3-sh-ATAD2灰度值 0.51±0.03 0.11±0.03 0.38±0.03 0.068±0.11

转染,细胞转染,细胞活力,浓度

.2 不同 5-Fu 浓度下 Huh7 细胞和 HCCLM3 细胞转染不同时间的细胞Huh7 HCCLM3转染48h转染后-48h未转染-72h转染后-72h未转染-48h转染后-48h未-±0.062 0.819±0.074 0.896±0.021 0.824±0.119 0.936±0.055 0.818±0.076 0.896±0.035 0.779±0.040 0.860±0.011 0.798±0.148 0.873±0.021 0.788±0.040 0.859±0.058 0.712±0.087 0.772±0.019 0.652±0.132 0.782±0.044 0.703±0.099 0.772±0.089 0.555±0.070 0.778±0.031 0.550±0.061 0.748±0.041 0.553±0.073 0.761±0.056 0.447±0.031 0.736±0.050 0.360±0.074 0.729±0.060 0.447±0.017 0.688

浓度,细胞活力,细胞转染

不同5-Fu浓度下HCCLM3细胞转染不同时间的细胞活力

【参考文献】