中国野生葡萄芪合成酶基因表达与抗白粉病功能研究

发布时间：2020-09-07 16:16

　　葡萄是世界性栽培的主要果树之一,不仅用途广泛,还具有良好的经济效益。生产上主栽品种欧洲葡萄高产优质风味佳,但其突出缺点是易感病,尤其是葡萄白粉病。葡萄中的白藜芦醇及其衍生物,在葡萄体内具有植保素的抗病功能,人食用后对身体健康具有抗癌、抗氧化和抗衰老等保健功能。因此,研究葡萄芪合成酶基因及其表达产物白藜芦醇的作用,是近年来研究者提高与改良酿酒和鲜食品种抗病性与品质的重要科学问题之一。本研究以中国野生葡萄种质为材料进一步分析了自然条件下芪合成酶组织水平和亚细胞水平表达特点;分析调控葡萄芪合成酶基因表达的信号途径和关键节点基因功能;研究诱导条件下芪合成酶及其产物合成、转运、降解和作用方式;研究芪类物质抗葡萄白粉病的作用,为利用中国野生葡萄的抗病性与芪合成酶基因改良欧洲葡萄抗病性提供依据,主要研究与结果如下:(1)中国野生华东葡萄芪合成酶基因VpSTS29及芪类物质呈现组织特异性表达。芪合成酶基因STS29在华东葡萄‘白河-35-1’和欧洲葡萄无核白的成熟叶片、毛葡萄‘丹凤-2’成熟果实中高表达。芪合成酶VpSTS29在转基因葡萄株系的根和成熟叶片中积累。芪合成酶表达的产物白藜芦醇及白藜芦醇苷主要分布在根、茎和成熟叶片中。在转基因拟南芥株系中芪合成酶VpSTS29及白藜芦醇苷积累在成熟的叶片中,并在发育进程维持较高水平的叶绿素含量和光化学效率以延迟植株衰老。(2)芪合成酶基因VpSTS29受生物与非生物胁迫诱导表达。中国野生华东葡萄‘白河35-1’在接种白粉菌后48 h至72 h和144 h,芪合成酶基因VpSTS29表达量较高。在其他生物小分子SA、ABA、MeJA和Ethylene、非生物类因子高盐、干旱、创伤、低温和UV-C光等胁迫处理条件下,VpSTS29基因均上调表达。此外,UV-C光处理诱导芪合成酶基因VpSTS29显著表达。进一步研究表明UV-C辐射诱导VpSTS29蛋白表达和芪类物质合成,且发现从细胞质向叶绿体迁移的现象。表型观察表明转基因无核白增强了对UV-C辐射的敏感性:叶片表现出干枯和烧焦状且降低H_2O_2的含量。定量RT-PCR分析表明VpSTS29转基因无核白改变了响应氧化还原、芪类物质合成和光胁迫相关基因的表达。拟南芥原生质体瞬时转化实验表明过表达芪合成酶基因VpSTS29也能降低细胞内部H_2O_2的含量。这些结果说明芪合成酶受环境胁迫诱导与表达,在细胞器间存在动态分布,并促进芪类物质的积累。综上芪合成酶基因VpSTS29既受生物胁迫诱导表达,又受非生物胁迫诱导表达。因此,该基因在葡萄生长发育过程中起到抗病与积极适应逆境胁迫的作用。(3)交叉嫁接实验结果表明芪合成酶VpSTS29蛋白不存在组织间的运输;在砧木过表达芪合成酶基因VpSTS29能显著提高接穗芪类物质含量。原位荧光观察结果表明VpSTS29蛋白主要分布在根尖分生区、茎的维管组织以及叶片的叶肉组织。亚细胞定位分析表明芪合成酶VpSTS29定位于细胞质以及球状体胞器。尼罗红染色、胞器标记基因共定位以及免疫组化分析证实该球状体为油体,且在特定发育阶段这些油体游离在细胞质和液泡中。蛋白表达模式分析证实定位于细胞质、油体和液泡中的绿色荧光为VpSTS29-GFP融合蛋白。共定位和抑制试验结果表明油体定位的VpSTS29是通过自噬途径转运至液泡的。综上在葡萄体内芪合成酶VpSTS29经内质网衍生的油体通过自噬途径转运至液泡中。芪合成酶及其产物在合成后存在动态再分配,以满足植物生长发育的需要。(4)RT-PCR分析表明在白粉菌接种后24 h至48 h转基因葡萄芪合成酶基因表达强度显著高于非转基因葡萄,芪合成酶基因VpSTS29改变了感病葡萄无核白内源芪合成酶基因及病程相关蛋白基因对白粉菌入侵的应答时间以及表达强度。通过大麦凝集素染色、基因枪轰击、原位荧光观察以及免疫印迹分析证明了转基因葡萄中芪合成酶VpSTS29是通过增强叶肉组织的表达以及合成有活性的葡萄素积累在侵入位点,进一步抑制病原菌入侵。在不含有芪合成酶基因的模式植物拟南芥中转入VpSTS29基因,转基因拟南芥积累VpSTS29蛋白和白藜芦醇苷,表现出抑制菌丝生长、局部发生过敏反应以及降低病原菌侵入率。外源施加水杨酸SA和白藜芦醇均能促进VpSTS29蛋白的表达和trans-piceid的累积。SA信号途径与白藜芦醇合成途径在病原菌防御中密不可分。这些结果表明,芪合成酶基因表达及芪类物质积累增强转基因VpSTS29欧洲葡萄无核白和拟南芥对白粉病抗性。(5)R2R3类型转录因子MYB14和MYB15在中国野生葡萄和欧洲葡萄中氨基酸序列较为保守,且直接结合芪合成酶基因VpSTS29的启动子。此外,通过中国野生毛葡萄‘丹凤-2’果实发育转录组数据鉴定了调控芪合成酶基因表达的bHLH类型的转录因子基因VqICE1。共表达分析表明VqICE1与26个芪合成酶基因存在表达相关性。酵母单杂交实验表明VqICE1能结合group-B亚家族的芪合成酶基因VqSTS15、VqSTS27和VqSTS48启动子区域,且降低这些芪合成酶基因启动子的转录活性。而VqMYB14和VqMYB15正调控这些芪合成酶基因启动子活性。VqICE1可与VqMYB14和VqMYB15在细胞核中相互作用,并直接结合VqMYB14启动子,降低VqMYB14的表达和trans-piceid的积累。白粉菌诱导条件下,野生型无核白葡萄中芪合成酶基因整体水平、MYB14和MYB15受诱导表达;过表达VqICE1降低了白粉菌侵染后期芪合成酶基因整体水平和MYB14的表达。这些结果表明VqICE1负调控芪合成酶基因的表达,以维持抗病作用后芪类物质含量恢复到正常水平。综上所述,芪合成酶基因VpSTS29及芪类物质呈现组织特异性,且受生物与非生物逆境胁迫诱导表达;芪合成酶及其产物在植物特定生长发育阶段通过自噬途径转运至液泡储藏;芪类物质在白粉菌诱导条件下迅速合成与积累,在病菌侵入位点参与抗病;此外,芪合成酶基因行使抗病功能后受转录因子基因调控。所以,芪合成酶基因VpSTS29具有增强葡萄中芪类物质积累与抗病性的作用。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S436.631
【部分图文】：

白藜芦醇,苯丙氨酸,途径

图 1-1 苯丙氨酸途径与白藜芦醇合成途径(Vannozzi et al. 2012neral phenylpropanoid pathway and stilbene branching pathway (Vann年来，研究者已经在葡萄科及葡萄制品中鉴定出至少四大类质。白藜芦醇不具有很高的抑菌活性(Adrian et al. 1997)，但侵时作为前体分子可以转化成具有较高生物活性的紫檀芪原菌进一步入侵。虽然白藜芦醇作为最基本单位可以转化成，但白藜芦醇在植物体内的降解机制尚未研究。研究表明maydis）、黄曲霉（Aspergillus fumigatus），球毛壳菌（Cha和富克尔核盘菌（Botryotinia fuckeliana）等微生物中存在一芦醇的酶，命名为 Resveratrol cleavage oxygenase (Rco) (Bre能断裂白藜芦醇分子两个苯环间的 C -Cβ双键，生成 3，羟基苯甲醛(Brefort et al. 2011)。除了向其他形式的衍生物转萄体内积累较低水平的白藜芦醇，可能也与此有关。白藜芦醇及其衍物的检测

氨基酸序列,合成酶,聚类分析,合成酶基因

聚类分析结果表明 VpSTS29 与 VvSTS27、VvSTS29 同源（图2-1）。氨基酸序列比对结果表明这些芪合成酶均编码 392 个氨基酸，同源性为99.32%，且 VpSTS29 在芪合成酶特征序列存在 Ser/Phe 点突变（图 2-2A）。RT-PCR 分析结果表明芪合成酶基因 VpSTS29 在华东葡萄‘白河-35-1’的根和基部叶片（14th）表达量最高，其次是位于第 6th节位叶片和嫩茎，最低是顶部叶片（2nd）（图 2-2B）。这一结果与大部分芪合成酶基因表达趋势一致。因此芪合成酶基因 VpSTS29 可以作为典型候选基因研究中国野生葡萄芪合成酶基因功能。此外，芪合成酶基因 VpSTS29 在华东葡萄‘白河-35-1’接种后 48 h 至 72 h 以及120 h 至 144 h 极显著上调表达（图 2-2C）。

氨基酸序列,合成酶基因,序列比对,葡萄

图 2-2 芪合成酶基因 VpSTS29 序列比对与表达特性分析。A，VpSTS29 氨基酸序列比对。B，芪合成酶基因 VpSTS29 在中国野生华东葡萄‘白河-35-1’不同组织表达分析。取生长至15 片叶时的‘白河-35-1’组培苗的根、茎和不同节位叶片（2nd、6th和 14th，顶部定义为 1st）等组织进行定量 RT-PCR 分析。C，葡萄白粉菌接种条件下芪合成酶基因 VpSTS29 表达分析。采用压片法接种华东葡萄‘白河-35-1’第 4-6 节位、生长状态一致的叶片。分别采集接种后 1-7 天样品进行 RT-PCR 分析。无菌水处理的 mock 作为对照。葡萄 actin 作为内参基因。采用最小显著法 least signifcant diference (LSD)进行数据显著性分析(**P < 0.01，*P <0.05)。标准差取自三个生物学重复。Figure 2-2 The sequence alignment and expression of VpSTS29 in different tissues and under U.necator inoculation. A, The sequence alignment of VpSTS29. B, The expression of VpSTS29 indifferent tissues. Samples including root, stem and leaves in different positions (2nd, 6thand 14th)were collected from leaves of V. pseudoreticulata accession Baihe-35-1 plantlet for the RT-PCRanalysis. the base was defned as the 1st leaf and the apex was defned as the 15th leaf. C, Theexpression of VpSTS29 induced by U. necator inoculation. The 4thto 6thleaves with the samegrowth status from V. pseudoreticulata accession Baihe-35-1 were inoculated with U. necator.

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