奶牛乳房炎相关天然免疫基因的筛选及其功能研究

发布时间：2020-09-11 18:51

　　近20年,奶牛遗传改良使奶牛产奶量得到显著提高,但奶牛感染各种病原微生物的风险却在增加。由乳房炎和子宫炎症等疾病造成的奶牛繁殖性能下降和生产寿命缩短,给奶牛养殖业造成了巨大损失。奶牛天然免疫力是应对各种病原微生物感染的第一道防线,通过遗传途径提高奶牛天然免疫力有助于提高其整体抵抗各种病原微生物感染的能力。全基因组差异基因表达分析技术的广泛应用,为了解奶牛天然免疫应答机制提供了帮助。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)芯片技术及全基因组关联分析(Genome-wide association studies,GWAS)为鉴定可用于提高奶牛天然免疫力的有效分子标记和基因提供了有力的技术支撑。本研究综合分析高通量基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)中公布的奶牛乳房感染病原微生物前后差异表达基因数据和文献报道的不同国家奶牛群体乳房炎GWAS研究结果,筛选与奶牛乳房炎相关的天然免疫候选基因及其信号通路,并在细胞和分子水平对重要候选基因的功能及其遗传变异效应进行了初步研究。1.奶牛乳房炎相关天然免疫候选基因主要利用Ingenuity?通路分析技术对公开报道的数据进行综合分析获得。(1)对GEO数据库中奶牛乳房感染大肠杆菌(E.coli)和乳房链球菌(S.uberis)前后差异表达基因分析,找到505个表达变化趋势一致的基因。对这505个基因进行功能、信号通路及基因网络互作分析,获得奶牛乳房应答不同病原微生物感染的共同机制。结果表明不同病原微生物感染乳腺均能引起的组织内生理变化主要是细胞增殖能力变强,凋亡被抑制,白细胞移动增强。信号通路方面,IL-6信号通路在放大炎症信号过程中发挥基础作用,IL-10和糖皮质激素受体信号通路在抑制过度的炎症反应方面发挥基础作用,白细胞依赖4条信号通路(Granulocyte Adhesion and Diapedesis、Agranulocyte Adhesion and Diapedesis、Leukocyte Extravasation Signaling、fMLP Signaling in Neutrophils)完成对血管内皮细胞的粘附与渗出。基因互作网络分析显示参与细胞存活和移动的基因之间存在显著的相互作用;(2)整理文献报道的7个国家奶牛乳房炎或体细胞评分(SCS)关联的GWAS研究,获得93个候选SNP分子标记,对这些标记2Mb范围内的1635个蛋白编码基因进行信号通路分析,其中182个基因与32条信号通路显著相关,这些通路大多与免疫、乳房健康及形态结构相关。这些通路中有9个基因是距离相应候选SNP最近的基因,分别是XCL1,PPP3CA,NFATC2,PRKAA1,HSF1,CSTF1,UGT2A3,CYP4F2,MAOA。(3)比较发现,候选SNP分子标记附近基因(1635个基因)中有48个基因在乳腺感染E.coli或S.uberis时表达发生变化(出现在505个基因中)。对这48个基因进行信号通路和基因网络互作分析,有11个基因显著影响白细胞渗出与粘附等5条信号通路“Granulocyte Adhesion and Diapedesis”、“Agranulocyte Adhesion and Diapedesis”、“Role of IL-17A in Psoriasis”、“Ephrin Receptor Signalling”和“Stearate Biosynthesis I(Animals)”。有16个介导组织存活(Organismal Survival)和细胞移动(Cellular Movemen)的基因之间有显著的相互作用;(4)综合基因在天然免疫反应中的作用及其在不同病原微生物感染奶牛乳房组织时的表达变化,同时考虑这些基因在染色体上与奶牛乳房炎显著关联SNP的距离,最终筛选得到17个参与白细胞渗出、炎症调控及乳房形态结构和健康的天然免疫候选基因(SELP,SELL,CXCL2,CXCL6,CXCL8,XCL1,ACTR3,BCAR1,FABP4,FASN,GNAS,SORBS1,HSF1,PPP3CA,NFATC2,PRKAA1,CYP4F2)。2.利用LPS刺激奶牛白细胞和血管内皮细胞为模型在体外初步研究了炎症反应发生时牛SELP和SELL的作用以及炎症信号引起的白细胞凋亡抑制作用。(1)牛SELP和SELL都参与了白细胞和血管内皮细胞之间的粘附。LPS引起的牛白细胞与血管内皮细胞之间的快速粘附增强反应依赖SELP。SELL与配体作用能激活白细胞增强其粘附能力;(2)牛血管内皮细胞主要粘附基因SELP,SELE,ICAM1,VCAM1表达在LPS刺激时显著上升,而白细胞中关键粘附基因CXCR2,PSGL-1表达在LPS刺激时下降,SELL基因表达在LPS刺激时变化不显著;(3)外周血颗粒白细胞自发凋亡在LPS刺激时下降,而无颗粒白细胞自发凋亡不受LPS刺激影响。白细胞凋亡抑制相关基因BCL2,BCL2A1,SGK1表达在LPS刺激时显著上升,可能是导致颗粒白细胞凋亡抑制的原因。3.对SELP,SELL以及SELE三个选择素家族基因外显子及侧翼区域多态性鉴定分型,并与奶牛疾病、繁殖、产奶和生产寿命等性状关联分析。(1)在SELP基因外显子发现9个SNP,其中3个位错义突变(引起氨基酸改变),SELL基因外显子上找到3个SNP,均为同义突变(不引起氨基酸改变),SELE基因外显子上找到1个SNP,为同义突变;(2)对SELP基因上5个SNP位点(SELPE4,SELPE5,SELPE6,SELPE8,SELPE13)、SELL上2个SNP位点(SELLE3,SELLE4)和SELE基因上1个SNP位点(SELEE14)以及SELP基因下游一个SNP位点rs41579632(报道与奶牛SCS显著关联)共9个SNP标记,在337头荷斯坦奶牛样本中进行分型。连锁不平衡分析发现分别位于SELP,SELL和SELE三个基因上的位点SELPE13,SELLE4,SELEE14之间呈一定程度连锁不平衡(r2在0.31-0.80之间)。SELP基因内SNP位点SELPE4和SELPE5完全连锁,并与SELPE6存在连锁不平衡(r2=0.5)。SELP,SELL,SELE三个基因上所有位点与rs41579632都不存在连锁不平衡(r20.1);(3)9个SNP位点分别与奶牛第二个泌乳期100天内患乳房炎和子宫疾病(子宫炎或子宫内膜炎)风险关联分析,发现一个SNP位点SELLE3与子宫炎症疾病患病风险显著相关,AA基因型奶牛患病风险显著小于其它两种基因型奶牛;(4)9个SNP位点分别与奶牛繁殖性状(初配年龄、初怀年龄、配种间隔、空怀时间、产犊年龄、配种次数、产犊间隔)关联分析。SELPE6与奶牛初怀所需配种次数、第一和第二胎产犊年龄、第一胎产犊间隔显著关联,GG型奶牛表现较优。SELPE8与奶牛初配年龄、初怀年龄、第一和第二胎产犊年龄均显著关联,GG型奶牛个体表现较优;SELPE13与SELLE4、SELEE14三个位点构成的单倍型组合与第二胎配种次数显著关联,H1H1单倍型组合为优势组合;(5)9个SNP位点分别与产奶性状(泌乳天数、305天奶量、乳脂率、乳蛋白率)关联分析,标记SELPE6与第一胎泌乳天数、第二胎305天奶量显著关联,AG型奶牛表现较优。SELPE13与第一胎乳脂率显著关联,AT基因型奶牛表现较优。SELEE14与第二胎305天奶量显著关联,CG型奶牛表现较优,标记rs41579632与第一胎乳脂率显著关联,AA型、AG型奶牛表现较优;(6)9个SNP位点不同基因型奶牛生产寿命进行分析,SELPE 5与奶牛生产寿命显著关联,AA型奶牛生产寿命显著低于AC和CC型奶牛。4.对奶牛重要天然免疫相关基因RelA和TREM1基因的外显子及侧翼区域多态性鉴定分型,并与奶牛疾病、繁殖、产奶和生产寿命等性状关联分析。(1)RelA基因外显子区域没有发现SNP位点,在第5内含子内发现一个SNP位点RelA-intron5。TREM1基因外显子发现2个SNP位点TREM-SP和TREM-3UTR,分别位于外显子剪接区和3’UTR区;(2)RelA-intron5与奶牛生产寿命、第一胎乳脂率及乳蛋白率、初产年龄、第一胎产犊间隔等多个性状显著关联,CC型奶牛表现较优。TREM-SP与本研究所有性状均无相关性,TREM-3UTR与奶牛生产寿命相关,AA型奶牛平均寿命显著低于另外两种基因型奶牛。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S858.23
【部分图文】：

金黄色葡萄球菌,信号通路,大肠杆菌,乳腺

-1 大肠杆菌（A）或金黄色葡萄球菌培养上清（B）激活牛乳腺上皮细胞主要（Gilbert et al 2013）. 1-1 Main signaling pathways supposed to be activated in MEC exposed to eithcrude LPS (A) or S. aureus culture supernatant (B). (Gilbert et al 2013)牛乳房天然免疫应答分子机制（基于基因差异表达研究）达谱芯片和高通量测序技术以及差异表达基因（Differential express分析技术的发展，为深入了解乳腺应对不同病原菌的应答机制提供前，大量乳房感染相关的基因差异表达高通量数据公布，为人们了应答分子机制提供了帮助。房组织为研究对象itenhuis 等人(2011)对产后 4-6 周的健康丹麦荷斯坦奶牛人工感染 Eli 引起的乳腺局部基因差异表达，发现感染 24 小时乳腺中上调 699

基因表达,信号通路,白细胞粘附,绿色

23图 2-1. 白细胞粘附与渗出信号通路Figure. 2-1. Granulocyte adhesion and diapedesis signaling红色表示感染引起的基因表达上调，绿色表示感染引起的基因表达下调。Red denotes gene up-regulation and green denotes gene down-regulation by infection.

免疫细胞,心血管疾病,血液系统,功能

i 和 S. uberis 感染奶牛乳房显著相关的基因网络作网络反映了不同信号通路之间的相互影响以及基因在不同基因一共构建了 25 个基因网络，其中 Network 3（图 2-2）与涉及的功能包括心血管疾病（Cardiovascular Disease），血液atological System Development and Function），免疫细胞贩运（。在这个网络中，趋化因子处于中心位置发挥直接作用，引炎症部位移动。从表达数据看，趋化因子上调倍数都非常大. coli 感染时上调了 82.99 倍（附表 1）。免疫细胞渗出越剧烈FKBIA 作为炎症抑制因子对该网络发挥着核心调节作用，将围内，避免对机体造成不可修复的损伤。但是在该网络中没子上调的因子，这说明两种细菌在启动免疫细胞移动的上游

【引证文献】